玉米转录因子ABP5在植物逆境应答中的功能分析

摘要

干旱、低温、高盐是影响植物生长和发育的主要环境因子。如何减少这些非生物逆境对植物的伤害，提高植物的抗逆能力，已成为目前农业生物科研工作者的一项重要课题。 在生物或非生物逆境下，植物体都会诱导产生大量脱落酸(ABA)和活性氧(ROS)。ABA是植物体内重要激素之一，参与植物多种生理生化过程，众多的研究证明ABA信号通路在非生物逆境中起着非常重要的作用。活性氧一方面作为信号分子参与细胞代谢、逆境信号传导，为植物生命活动所必需；但是活性氧的大量积累又会对植物体造成严重的损伤。因此，活性氧水平在植物体内是受到严格控制的，其产生与清除处于动态平衡之中。了解植物体抗氧化基因的表达调控机制对改良作物抗逆性有重要意义。 过氧化氢酶(CAT)是植物体内活性氧清除体系的重要成员。玉米的CAT1基因受ABA的调控，其启动子区域的ABRE2是响应ABA调控所必需的顺式元件。本实验室利用酵母单杂交的方法，对玉米幼胚17天和21天cDNA文库进行筛选，克隆到与ABRE2特异结合的bHLH类转录因子ABP5。得到该基因全长cDNA序列1652bp，其中开放阅读框为1020bp，并初步证明该基因在玉米中的表达受逆境和ABA的诱导。 本文的主要研究目的是鉴定ABP5的转录因子活性，并利用转基因的手段分析ABP5在植物逆境反应中的功能，试图弄清ABP5与ABA、活性氧水平控制、抗逆相关基因表达以及植株抗逆性的关系。 本论文取得的主要研究结果如下： 1.利用酵母单杂交的方法验证ABP5与CAT1基因启动子顺式作用元件ABRE在酵母体内存在特异性相互作用。 2.构建pDB-ABP5ORF/N/M/C载体，在酵母Mav203中证实ABP5不具有转录激活功能。 3.构建pCHF3-ABP5-GFP植物稳定表达载体，转化拟南芥，阳性植株在激光共聚焦扫描显微镜下观察。结果显示ABP5具核定位信号，定位于转基因拟南芥细胞的细胞核中。 4.通过Real-timePCR的方法，分析不同逆境处理下ABP5在玉米中的内源表达情况。ABA、NaCl、PEG、4℃低温诱导ABP5的表达。H2O2抑制ABP5的表达。 5.对ABP5过表达系和野生型拟南芥植株进行表型观察，发现ABP5转基因与野生型植株在种子萌发和早期生长阶段表型无明显差异。但ABP5基因能够使转基因拟南芥植株提前抽苔和开花，加快转基因植株生长速度。 6.通过ABA平板上种子萌发率、幼苗存活率和根伸长实验，证明ABP5提高了转基因植物对ABA的敏感性。 7.对ABP5过表达系5-33-5、5-4-2、5-26-7，RNAi系5R-3-29和野生型拟南芥植株进行NBT和DAB染色，发现转ABP5基因过表达系植株体内的活性氧(超氧阴离子，过氧化氢)水平高于野生型；RNAi系植株体内的活性氧水平低于野生型。说明ABP5能促进植物体内ROS的积累。 8.对转基因拟南芥纯系植株和野生型进行抗非生物逆境生理实验，证明转ABP5基因拟南芥对寒、旱、盐及氧化逆境的耐受性低于野生型。 9.通过Real-timePCR分析，在正常条件和NaCl处理条件下，抗逆相关基因RD29A、RD29B、COR47、COR414、CAT3、CSD2在ABP5转基因拟南芥中的表达量均低于野生型；RD22、ERD5、CSD1、RbhoD、ZAT12表达量均高于野生型；COR15A、FSD3、PER72表达量变化趋势不同。 10.基因芯片分析显示，转基因拟南芥中一些与ROS代谢、生物逆境及开花相关的基因表达发生变化。 由上述结果初步推测，ABP5可能作为一类调控蛋白，参与ABA依赖性逆境信号通路，并对ROS水平起重要调节作用。本研究试图弄清非生物逆境中的信号转导和基因表达调控机制，对于改良植物的抗逆性有重要的理论和实践意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

第一章引言

1.文献综述

1.1非生物逆境

1.2非生物逆境信号转导的分子机制

1.3活性氧(ROS)

2.研究背景，目的和意义

3.技术路线

第二章ABP5的转录因子特性分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 ABP5与拟南芥同源基因序列比对

2.2 ABP5与ABRE元件结合特异性分析

2.3 pDB-ABP5系列载体的构建

2.4 ABP5在酵母中转录调控功能分析

3.小结

第三章ABP5在拟南芥中的亚细胞定位

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 pCHF3-ABP5-GFP融合蛋白表达载体的构建

2.2农杆菌转化结果

2.3拟南芥转化结果

2.4激光共聚焦扫描显微镜观察ABP5蛋白定位

3.小结

第四章ABP5在玉米中的表达谱分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1引物效率验证实验

2.2 ABP5在玉米中的表达谱

3.小结

第五章转ABP5拟南芥纯系植株的获得

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1植物稳定表达载体的构建

2.2农杆菌转化结果

2.3拟南芥转化结果

2.4最终获得的拟南芥材料(过表达系及RNAi系)

2.5 ABP5本基因表达

3.小结

第六章ABP5在转基因拟南芥中的生理功能分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1正常培养条件下，转基因与野生型植株表型观察

2.2植株对ABA敏感性分析

2.3 NBT及DAB染色实验

2.4 1μM MV平板上转基因拟南芥的存活率变化

2.5转ABP5拟南芥对盐胁迫的耐受性降低

2.6转ABP5拟南芥对旱胁迫的耐受性降低

2.7转ABP5拟南芥对寒胁迫的耐受性降低

3.小结

第七章转ABP5拟南芥的基因表达分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1拟南芥RNA的提取

2.2抗逆相关基因的表达量变化

2.3基因芯片结果

3.小结

第八章结论与讨论

参考文献

致谢

作者简历