三叶草属三种植物遗传多样性的RAPD分析

摘要

三叶草属(TrifoliumL.)植物中有很多是世界上非常著名的优良栽培牧草，同时也是利用很广泛的草坪草，主要分布在世界温带地区。由于三叶草属植物喜温暖湿润气候，在干旱和寒冷的内蒙古地区引种红三叶和白三叶等优质三叶草属牧草至今未获成功。但是在内蒙古、新疆的北部地区，由于严冬时有积雪覆盖，野生红三叶、白三叶及同属的野火球均可以安全越冬，对这些抗寒性强的野生材料进行研究将为红三叶和自三叶在更大范围内推广奠定基础。 本研究利用随机多态性DNA(RAPD)标记技术对采集于内蒙古、新疆的野生野火球、白三叶和红三叶等三种三叶草材料进行种内和种间遗传多样性分析，探讨种内不同材料间的亲缘关系，通过对材料的特异片段的筛选及鉴定，以获得材料的特异标记，以期对野生材料的多样性有初步的了解，为三叶草种质资源和育种研究提供依据。 本试验对100条随机引物进行了筛选，最后确定了7条引物，通过优化试验因子确定了最优组合的RAPD反应体系，对20份材料进行了扩增。利用7个引物扩增的总谱数为121条，其中多态性条带为117条，多态性比率为96.7％，不同种扩增的谱带数分别为野火球58、白三叶88、红三叶70，其多态性比率分别为77.6％，75％，81.4％。用非加权组平均法(UPGMA)构建系统发生树，探讨了各材料之间的遗传关系。种内分析显示，三个种的聚类结果与其地理分布及生境有很大的相关性;作为对照的栽培品种与野生材料问有较大的差异；在白三叶材料中，采集于牙克石的白三叶与其它白三叶材料差异很大，可以作为特殊材料进行研究。种间聚类显示白三叶和红三叶的亲缘关系较为接近。通过分析DNA图谱，得到3个重复性好的特异标记片断，0PB08－257，OPC11－745可以将三种三叶草区分开来，OPB08—300可以鉴别海发白三叶与野生白三叶。

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第一章文献综述

1.1三叶草概述

1.1.1三叶草的起源与分布

1.1.2三种三叶草地理分布

1.2遗传标记的研究进展

1.2.1遗传多样性的概念及意义

1.2.2遗传标记简介

1.2.3常用分子标记的原理及其应用

1.3三叶草遗传多样性研究概况

1.3.1形态学水平

1.3.2细胞学水平

1.3.3生化水平

1.3.4 DNA分子水平

1.4本研究的目的和意义

第二章研究内容

2.1试验材料

2.1.1供试材料

2.1.2主要生化试剂

2.1.3主要仪器

2.2试验方法

2.2.1三叶草基因组DNA提取

2.2.2三叶草基因组DNA检测

2.2.3 RAPD反应体系的建立和优化

2.2.4 RAPD产物的观察

2.2.5引物筛选及RAPD分析

2.2.6数据分析

第三章结果与分析

3.1三叶草基因组DNA的检测结果

3.1.1 DNA电泳检测结果

3.1.2 DNA总浓度的检测

3.2 RAPD反应体系的优化及结果

3.2.1模板DNA用量对扩增结果的影响

3.2.2 Taq DNA聚合酶用量对扩增结果的影响

3.2.3引物用量对扩增结果的影响

3.2.4 Mg2+浓度对扩增结果的影响

3.2.5 dNTP用量对扩增结果的影响

3.2.6 PCR反应条件的优化结果

3.3引物筛选

3.4不同材料各位点出现谱带的频率及特异性条带的筛选

3.5三个种的遗传距离和聚类分析

3.5.1 6份野火球材料间的遗传距离和聚类分析

3.5.2 8份白三叶材料间的遗传距离和聚类分析

3.5.3 6份红三叶材料间的遗传距离和聚类分析

3.5.4三个种20份材料间的遗传距离和聚类分析

第四章讨论和结论

4.1讨论

4.1.1三叶草基因组DNA的提取方法及其质量

4.1.2 RAPD反应体系的优化及反应的稳定性

4.1.3 RAPD反应中引物的筛选

4.1.4 RAPD反应图谱确定的材料间的亲缘关系

4.1.5特异性标记的筛选

4.2结论

参考文献

致谢

作者简历