维生素E抗紫外线诱导的北京油鸡成纤维细胞凋亡作用的研究

摘要

本文以北京油鸡胚胎为材料，采用组织块贴壁培养法进行细胞培养，系统阐述了在紫外线照射诱导的北京油鸡成纤维细胞的凋亡过程中维生素E对细胞凋亡的影响。应用MTT法进行细胞增殖检测，AnnexinV-EGFP/PI检测磷脂酰丝氨酸结合力的强弱，Rh-123检测线粒体膜电位的变化，FCM检测细胞周期的变化，RT-PCR检测紫外线及维生素E作用前后bcl-2、bax、fas、caspase-3基因mRNA表达水平的变化。本实验结果如下： 1.紫外线对成纤维细胞有明显的促凋亡作用，而且具有作用时间依赖性，照射时间越长，凋亡效果越明显，当照射达32min后，细胞生长基本受到全面抑制。维生素E能明显抑制细胞的凋亡，浓度越大抑制效果越明显。但是，当达到50μmol/L后，用药组的细胞活性反而低于非用药组，表明维生素E对细胞凋亡的抑制也是在一定限度内发挥作用，超过限度，细胞生长受到抑制。 2.本实验通过流式细胞仪定量检测，表明维生素E有较强的抑制凋亡作用。维生素E作用经紫外线照射的细胞后，通过AnnexinV-EGFP标记结合流式细胞仪检测发现细胞凋亡比例有所降低，并且，随着细胞培养时间的延长，维生素E抑制细胞凋亡的效果增强。 3.本实验采用Rh-123标记结合流式细胞仪检测发现，维生素E作用于紫外线照射诱导的凋亡细胞后，线粒体膜电位升高。但是，随着培养时间的延长，线粒体膜电位逐渐降低。由此可以推测，线粒体参与了维生素E抑制细胞凋亡的过程。 4.本实验通过检测维生素E作用于紫外线照射诱导的凋亡细胞的细胞周期，发现经紫外线照射的细胞发生S期阻滞，导致G2/M期细胞的减少。而维生素E的作用可以逆转紫外线照射诱导的S期阻滞，引起G2/M期细胞的增加。细胞在G2/M期比率的提高，允许细胞在有丝分裂以前有更多的时间进行修复。维生素E处理的结果使细胞在G2/M期增加，所以维生素E可能通过调控细胞周期的分配进而发挥抗凋亡的作用。 5.RT-PCR结果显示紫外线作用后，bcl-2基因较对照组无明显变化，bax、fas、caspase-3基因较对照组表达量明显升高，bax/bcl-2升高。加入维生素E后，bcl-2、caspase-3基因表达量较对照组明显升高，而bax、fas基因无明显变化，bax/bcl-2降低。这表明紫外线可能通过线粒体及死亡受体途径诱导细胞凋亡，而维生素E的作用，可能引起了Caspase家族的级联反应，Bcl-2家族通过上调bcl-2基因的表达量来抑制凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1细胞凋亡及其信号转导机制

1.1.1细胞凋亡及其形态学变化

1.1.2细胞凋亡的影响因子

I.1.3细胞凋亡信号的传导途径

1.1.4细胞凋亡的调控执行

1.1.5细胞凋亡的生物学意义

1.2紫外线辐射的研究与应用

1.2.1紫外线辐射对生物伤害的分子学基础

1.2.2生物细胞对紫外线辐射增强的反馈调控

1.2.3紫外线辐射研究概况

1.3维生素E的抗氧化功能

第二章维生素E抑制紫外线照射诱导细胞凋亡模型的建立

2.1试验材料

2.1.1试验动物

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂及配制

2.2试验方法

2.2.1细胞培养

2.2.2细胞生长曲线绘制

2.2.3细胞凋亡模型的构建

2.3试验结果与分析

2.3.1原代细胞的生长

2.3.2传代细胞的生长

2.3.3细胞生长动力学

2.3.4细胞凋亡模型的构建

2.4讨论

2.4.1细胞培养方面的问题

2.4.2凋亡模型构建方面的问题

第三章维生素E抑制细胞凋亡机制的研究

3.1实验材料

3.1.1实验动物

3.1.2主要试剂及其配制

3.1.3主要仪器设备

3.2实验方法

3.2.1细胞培养

3.2.2细胞形态学观察

3.2.3 Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡早期检测

3.2.4 Rh-123检测线粒体膜电位的变化

3.2.5 FCM检测细胞周期的变化

3.2.6 RT-PCR检测细胞凋亡相关基因的变化

3.3试验结果与分析

3.3.1细胞凋亡的形态学观察

3.3.2维生素E对磷脂酰丝氨酸结合力的影响

3.3.3维生素E对线粒体跨膜电位的影响

3.3.4维生素E对细胞周期分布的影响

3.3.5维生素E抗紫外线诱导的细胞凋亡基因mRNA水平的变化

3.4讨论

3.4.1细胞凋亡检测的影响因素

3.4.2凋亡相关基因的表达

第四章结论

4.1维生素E抑制紫外线照射诱导细胞凋亡模型的建立

4.2维生素E抑制细胞凋亡作用的研究

参考文献

致 谢

作者简历