松材线虫、相似穿孔线虫半胱氨酸蛋白酶基因的分离与特性分析

摘要

半胱氨酸蛋白酶(Cysteineprotease，CP)是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶。线虫的半胱氨酸蛋白酶大多表达在虫体的食道腺、肠细胞中，发挥其水解活性，是线虫的主要“消化酶”。半胱氨酸蛋白酶在线虫的入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需要的营养成分、蜕皮、消化宿主蛋白、免疫逃避等过程中发挥关键作用，与多种重要动植物疾病密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。已有大量报道证明半胱氨酸蛋白酶在动物寄生性线虫、自由生活线虫的发育、免疫活性等方面都具有关键作用。而在植物固着性寄生线虫(如大豆胞囊线虫、根结线虫)中的几例报道也预示了它的重要性，而在植物迁移性寄生线虫中至今未见对其的报道。因此，本研究分别从两种植物迁移性内寄生线虫：松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)和相似穿孔线虫(Radopholussimilis)中分离得到半胱氨酸蛋白酶基因全长及片段，并对松材线虫半胱氨酸蛋白酶进行原核表达。本研究为进一步测定蛋白酶活性，更好的了解此蛋白酶的功能奠定了理论基础，也为植物寄生性线虫的防治提供新的靶标和思路。主要研究结果如下： 1.克隆基因全长：采用同源克隆法，首先筛选GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中收录的线虫半胱氨酸蛋白酶(CP)的氨基酸序列，利用DNAman软件进行同源比对分析并根据植物寄生性线虫CP密码子偏好设计简并引物，通过RACE法获得植物迁移性寄生线虫：松材线虫、相似穿孔线虫CP基因的cDNA全长并进行深入分析。本研究从松材线虫中得到两个L型半胱氨酸蛋白酶基因，分别命名为Bx-CPL1、Bx-CPL2，其cDNA全长分别为1220bp、1161bp，GenBank登录号依次为EU651860、EU659123；从相似穿孔线虫中得到一个L型半胱氨酸蛋白酶基因和一个S型半胱氨酸蛋白酶基因，分别命名为Rs-CPL1和Rs-CPS，其中Rs-CPL1的cDNA全长为1388bp，登录号EU659124；Rs-CPScDNA全长为1112bp，登录号EU659125；同时从相似穿孔线虫中得到498bp的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA片段。生物信息学软件详细分析以上序列及构建系统发育树，结果证明这四个基因全长及一个cDNA片段均具有CP家族的典型特征。 2.基因DNA全长扩增：以松材线虫基因组DNA为模板，扩增松材线虫两个CP基因Bx-CPL1、Bx-CPL2的DNA全长，结果表明松材线虫这两个目的基因均由3个外显子和2个内含子组成，获得了松材线虫CP基因结构上的基本信息。 3.原核表达：通过双酶切、连接分别构建Bx-CPL1、Bx-CPL2的表达载体，将Bx-CPL1基因、Bx-CPL2基因成功的克隆到表达载体pET-28a(+)多克隆区域上，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导得到目的融合蛋白pET-28a-Bx-CPL2的表达，而pET-28a-Bx-CPL1未能得到可见表达。所得的pET-28a-Bx-CPL2的原核表达为下一步提纯融合蛋白、Westernblot、验证蛋白酶活性提供依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章文献综述

1.1松材线虫及其危害

1.1.1分类地位

1.1.2形态特征

1.1.3起源与分布

1.1.4生活史

1.1.5寄主范围及危害症状

1.1.6 防治

1.2相似穿孔线虫及其危害

1.2.1分类学地位

1.2.2生物学特性

1.2.3危害现状

1.2.4入侵风险

1.2.5控制与防治

1.3线虫的半胱氨酸蛋白酶研究概况

1.3.1半胱氨酸蛋白酶家族简介

1.3.2半胱氨酸蛋白酶在不同线虫体内的分布

1.3.3线虫半胱氨酸蛋白酶的生物学功能研究进展

1.3.4小结

第二章立题背景与技术路线

2.1立题背景

2.2技术路线

第三章材料与方法

3.1试验材料：

3.1.1相似穿孔线虫的培养、收集：

3.1.2松材线虫的培养、收集

3.2器材与试剂

3.2.1试验器材

3.2.2主要试剂和酶类

3.3试验方法

3.3.1 cDNA的合成

3.3.2目的基因片段的克隆

3.3.3 RACE法获得全长cDNA

3.3.4基因内含子的扩增

3.3.5基因的原核表达

第四章结果与分析

4.1 RNA的提取

4.2基因片段的分离与生物信息学分析

4.3 RACE结果与分析

4.3.1 3'RACE扩增片段

4.3.2 5'RACE扩增片段的检测

4.4靶标基因序列分析

4.4.1靶标基因蛋白比对结果

4.4.2靶标基因的命名

4.4.3基因编码蛋白的结构分析及功能预测

4.4.4系统发育树的构建与分析

4.5松材线虫CPL基因内含子扩增结果与分析

4.5.1 DNA的提取

4.5.2内含子的扩增

4.6 Bx-CPL基因原核表达结果与分析

4.6.1目的片段的鉴定

4.6.2目的融合蛋白的表达

第五章结论与讨论

参考文献

附录

致谢

作者简历