猪戊型肝炎病毒ORF2基因的原核表达及单克隆抗体的制备

摘要

戊型肝炎(Hepatitis E)是一种由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的经消化道传播的人畜共患传染病。主要通过粪-口方式传播,在卫生条件较差的地方,水污染是暴发流行的主要原因,在亚洲、非洲和美洲等发展中国家呈现大规模爆发,发达国家主要以散发形式流行。该病在青少年中容易发展为暴发性肝炎,可以导致孕妇流产,病死率高达21％。HEV是一种线性单股正链、无囊膜的RNA病毒。病毒基因组由3个开放阅读框组成:ORF1、ORF2和ORF3,ORF1编码非结构蛋白,ORF2编码核衣壳结构蛋白,ORF3编码细胞骨架相关的磷蛋白。大量研究发现ORF2编码产生的核衣壳蛋白包含大量的抗原决定簇,靠近C端的2／3部分存在的大量优势B细胞表位,还有多个诱导产生中和抗体的抗原结合位点。ORF2编码的衣壳蛋白三个线性结构域,分别S结构域、P1结构域和P2结构域。
　　 HEV分布广泛,危害严重。HEV抗体广泛存在于非人灵长类、各种啮齿类以及猪鸡等家畜家禽中,并在人和猪等动物体内均检测到HEV核酸。因此,通过对猪源swCH189株HEV ORF2基因的分段原核表达,获得四个结构域的融合蛋白,不仅有助于了解S结构域蛋白的自我组装功能,P1结构域维持衣壳蛋白稳定性的机制,而且制备了5株针对P12蛋白的单克隆抗体,而且通过单克隆抗体的制备筛选P2结构域的抗原表位。可以为了解HEV衣壳蛋白组装机制,稳定机制和不同结构域的结构功能关系等提供实验基础,对于猪源HEV的诊断和建立一种特异性较高的ELISA诊断试剂盒等具有重要意义。
　　 本研究首先采用RT-PCR方法获得戊型肝炎病毒swCH189株ORF2全基因序列。根据ORF2蛋白线性结构域的分布和生物学软件预测结果设计四对引物,分别从构建的重组ORF2阳性质粒扩增S、P1、P2和P12四个基因片段,将得到的四个基因亚克隆到pET-32a(+)载体中,分别构建融合表达载体pET-S、pET-P1、pET-P1和pET-P12。重组表达载体分别转化合适的表达菌Rosetta(DE3)或者BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析结果,得到截短表达蛋白His-S、His-P1、His-P2和His-P12,大小分别为41kDa、35kDa、45kDa和58 kDa,片段大小和预期分子量相符,主要以包涵体形式存在。采用Promege His标签蛋白纯化系统进行纯化后。得到高纯度的目的蛋白,可以直接用于免疫试验动物或者单抗的制备。纯化蛋白分组免疫兔子,可以获得高滴度的抗戊肝病毒结构蛋白多克隆抗体。免疫兔子血清作为一抗对表达蛋白进行Western blot鉴定其免疫原性结果说明:表达蛋白均与免疫兔子血清具有较强的反应原性。
　　 本实验采用纯化的融合蛋白His-P12免疫实验小鼠进行单克隆抗体的制备,细胞分泌上清进行间接ELISA和Western Blot检测。实验最终筛选出5株(1H3、3G11、4A7、3G12、4A2)为针对His-P12目的蛋白的杂交瘤细胞株,同时采用间接ELISA和Western blot检测细胞分泌上清的反应原性。结果说明,5株杂交瘤细胞株可以稳定分泌性质均一的单克隆抗体为筛选ORF2上的抗原表位和制备戊肝ELISA诊断试剂盒的研制提供相关的基础研究。