北京油鸡肺脏间充质干细胞的分离、培养与诱导分化研究

摘要

本实验对北京油鸡肺脏间充质干细胞的分离、扩增、分化等特性进行了研究,建立了适合北京油鸡肺脏间充质干细胞体外分离、培养的体系及鉴定和诱导分化的方法,为今后进一步研究北京油鸡肺间充质干细胞提供技术平台。本实验是以9～14日龄北京油鸡肺脏组织为材料,Ⅳ型胶原酶消化,percoll分离,获得肺间充质干细胞。进行免疫组化和RT-PCR鉴定,比较了3种培养体系对北京油鸡肺间充质干细胞增殖的影响,并对体外培养的北京油鸡肺脏间充质干细胞进行了诱导分化潜能的探索。实验结果如下:
　　 1.对9～14日龄北京油鸡肺脏间充质干细胞的细胞分离情况进行了对比,并且设计了三种培养体系摸索了适合北京油鸡肺脏间充质干细胞生长的最佳体系,建立了北京油鸡肺脏间充质干细胞体外分离培养的方法:以10日龄北京油鸡鸡胚肺脏组织为材料,Ⅳ型胶原酶消化,percoll分离,获得肺间充质干细胞。采用DMEM／F-12基础培养基+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+100IU／ml青霉素+100μg／ml链霉素+10 ng／ml bFGF的培养体系对北京油鸡肺脏间充质干细胞进行体外分离培养时,获得的效果最佳。
　　 2.体外培养的北京油鸡肺脏间充质干细胞呈长梭形。细胞的生长经历了第一阶段潜伏期、第二阶段对数生长期和第三阶段平台期,呈“S”形生长曲线。在体外北京油鸡肺脏间充质干细胞可以传代至第25代细胞。各代次的细胞群体倍增时间分别为P3代37.3 h,P15代46.1 h,P21代54.1 h。说明了随着培养代次的提高,细胞生长速度开始下降,到达20代以上,细胞生长缓慢。25代时,空泡化严重,细胞生长缓慢,形态不立体,传代之后基本无贴壁细胞,无法继续培养。
　　 3.对体外培养的肺脏间充质干细胞进行冻存与复苏实验,结果发现P3、P15、P21代细胞复苏后较冻存前的细胞活率明显下降。所以在冻存液的配制以及人为操作方面还需进一步的研究。
　　 4.对体外培养的北京油鸡肺脏间充质干细胞进行了免疫荧光及RT-PCR鉴定。结果表明,北京油鸡肺脏间充质干细胞对标记物CD29、CD44、CD71、CD73以及Vimentin呈阳性表达,而对标记物CD34呈阴性表达。符合肺脏问充质干细胞的特性。
　　 5.将北京油鸡肺脏间充质干细胞在适宜的诱导条件下向成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞三个方向进行了诱导,通过免疫学和RT-PCR两种方法鉴定所诱导的细胞为目的细胞,验证了北京油鸡肺脏间充质干细胞的分化潜能。