镰形扇头蜱抗凝血分子在昆虫细胞中的重组表达和RNA干扰研究

摘要

蜱是一种常见的动物体表寄生虫,在生物分类学上属于节肢动物门、蛛形纲、蜱螨目、后气门亚目、蜱总科。它们在世界各地广泛分布,侵袭哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类等动物,是仅次于蚊子的第二大疾病传播媒介,严重危害着人和动物的健康。为了持续地吸血,蜱的唾液腺分泌大量的生物活性分子。这些生物活性分子包含抗凝血分子,免疫调节分子,粘合剂蛋白分子,毒素,抗菌多肽等。它们在蜱对抗宿主凝血系统、免疫系统和传播病原体等方面发挥着重要的作用。为探索新型蜱及蜱传疾病防治策略,鉴定并研究蜱唾液腺重要生物活性分子的功能是重要内容,本研究针对镰形扇头蜱的抗凝血分子开展研究。
　　 本实验室成功构建了镰形扇头蜱吸血前后的唾液腺抑制消减杂交cDNA文库,并从cDNA文库中克隆出两个具有Kunitz结构域的抗凝血分子编码基因,命名为Rhipilin-1和Rhipilin-2基因。在此基础上,本研究以pFastbae HTA为表达载体,构建真核表达重组质粒Rhipilin-1-pFastbaeHTA、Rhipilin-2-pFastbac HTA。将重组质粒转化至DH10 Bac中,抽提重组杆粒Rhipilin-1-Bacmid、Rhipilin-2-Bacmid,将重组杆粒转染至sf9昆虫细胞内进行真核表达,并采用间接免疫荧光和Western blotting的方法对重组表达的蛋白进行了鉴定。结果分别获得了大小为24.5kDa的Rhipilin-1重组蛋白和大小为28.3kDa的Rhipilin-2重组蛋白。对重组蛋白Rhipilin-2进行了抗凝血活性试验和酶活性抑制试验,结果表明,重组Rhipilin-2蛋白,可以显著延长兔血的部分凝血酶活化时间,具有抗凝血活性。重组Rhipilin-2蛋白的酶活性抑制实验显示,对属于丝氨酸类蛋白的人弹性蛋白酶、胰蛋白酶的抑制作用明显,并具有浓度依赖特性。
　　 本研究还应用了RNA干扰技术,研究了二个抗凝血分子Rhipilin-1和Rhipilin-2的生物学功能。用含有T7启动子的方法在体外合成dsRNA,分别以显微注射的方式注射到蜱体内,干扰Rhipilin-1和Rhipilin-2目的基因,观察基因干扰后,对蜱吸血的生物学特性的影响。结果发现干扰Rhipilin-1和Rhipilin-2基因后,和对照组相比较,镰形扇头蜱的24小时吸附率和饱血重量都明显下降,表明二个分子在维持蜱正常吸血的过程中具有重要作用。
　　 综上所述,本研究用杆状病毒表达系统对镰形扇头蜱抗凝血基因Rhipilin-1和Rhipilin-2进行了真核表达,并对重组蛋白Rhipilin-2生物学活性做了初步研究。应用RNA干扰技术分析了沉默Rhipilin-1和Rhipilin-2基因对镰形扇头蜱吸血的生物学功能的影响,研究结果为这二个抗凝血分子的进一步研究打下了基础。