p53在日本脑炎病毒复制及其致病性中的作用

摘要

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种经蚊虫传播,能引起人中枢神经系统损伤的黄病毒。目前控制日本脑炎病毒的主要手段是疫苗预防和蚊虫清除,但是全球每年仍有近50000的病例和近30％的死亡率。因此,仍需要开发有效的抗病毒策略来弥补疫苗控制的不足。了解病毒与宿主细胞的相互作用,有利于寻找有效的抗病毒策略。p53具有抗肿瘤、DNA修复、促细胞凋亡和抗病毒等功能,许多病毒在感染过程中都与p53相互关联,但至今尚未见到JEV与p53相互作用的报道。为了探讨p53在JEV感染中的作用,我们开展了如下研究:
　　 1、JEV感染降低p53的蛋白水平和转录活性。本研究首先用JEV(SH-JEV01株)感染A549和PIEC细胞,用间接免疫荧光(IFA)和western blot方法检测细胞内p53的细胞定位和蛋白水平。IFA结果显示在感染细胞内,p53核聚集明显减少,并且这种减少是一种普遍现象；western blot结果显示,JEV感染A549细胞48h或感染PIEC细胞12h后,p53蛋白逐渐减少；将细胞质和细胞核进行分离,Western blot结果显示细胞质和胞核内的p53均减少。通过p53荧光素酶活性分析,JEV感染后细胞内p53活性显著下降p<0.05)；Western blot结果显示p53靶基因IRF9的表达明显减少。另外,IFA结果显示,在JEV感染细胞内NS3与p53存在细胞共定位现象；免疫共沉淀试验(co-IP)证实NS3能与p53结合。通过这部分的研究,我们首次发现JEV感染能降低p53蛋白水平和活性,并证实NS3蛋白与p53相互结合,提示NS3可能参与了对p53功能的影响。
　　 2、p53抑制JEV的复制。为了观察p53对JEV复制的影响,本研究通过RNAi技术将A549细胞内p53进行基因沉默,然后观察JEV的复制。通过western blot和定量PCR分析,发现转染150riM siRNA48h后能有效的将p53基因沉默,并通过细胞活率测定和流式细胞分析,证实转染p53 siRNA在短期内不影响细胞的生长特性及细胞周期。将JEV感染p53基因沉默的A549细胞,IFA试验显示p53基因沉默组NS3阳性的细胞数明显增多;定量PCR试验表明,p53基因沉默细胞中NS3 mRNA水平显著高于对照组(p<0.01)；Western blot结果表明,p53基因沉默细胞中NS3、E蛋白的表达明显高于对照组；空斑试验数据显示,p53基因沉默细胞产生的病毒粒子明显多于对照组(10～100倍)。上述结果说明,在细胞模型中p53能有效抑制JEV的复制。
　　 3、JEV诱导的细胞凋亡不依赖p53。为了观察p53在JEV诱导细胞凋亡中的影响,将JEV感染p53基因沉默的A549细胞,分析细胞凋亡的情况。通过台盼蓝排斥试验,发现JEV感染p53基因沉默细胞后,引起更多细胞的发生死亡(p<0.05)；通过原位末端转移酶标记试验(TUNEL)和流式细胞术(Annexin V-PI)分析细胞凋亡情况发现,JEV感染p53基因沉默细胞诱导更多细胞发生凋亡(p<0.05)。从小鼠全基因表达芯片的结果中发现(见第六章),在JEV感染的p53基因敲除(p53KO)小鼠脑组织中,具有促凋亡活性的Xafl表达水平要高于p53野生型(p53WT)小鼠89倍；定量PCR结果显示在JEV感染的p53基因沉默细胞中,Xafl的表达显著高于对照组(p<0.05)。上述结果说明JEV诱导的细胞凋亡不依赖p53,反而由于p53的缺失,促进了JEV诱导的细胞凋亡.
　　 4、p53抑制JEV对小鼠的致病性。为了观察p53在JEV致病性中的作用,通过皮下注射将JEV感染p53KO和p53WT小鼠。结果发现,p53KO小鼠表现为症状出现早、病程短、死亡率高。通过定量PCR测定外周血中NS3 mRNA水平,结果显示JEV在感染后第3天病毒血症达到峰值,并且p53KO小鼠病毒血症显著高于野生型小鼠(p<0.05)。免疫组化结果显示,在p53KO小鼠脑组织中NS3抗原阳性的细胞数要明显多于p53WT小鼠。上述结果说明在小鼠体内p53也能抑制JEV的复制。病理切片的结果显示,p53KO小鼠脑组织中(大脑皮层和海马)的胶质细胞分泌更多的炎性渗出物。ELISA结果显示p53KO小鼠脑组织中TNF-α和IL-6的表达量要显著高于p53WT小鼠(p<0.05)。上述结果说明,JEV感染p53KO小鼠引起更严重的炎症反应。
　　 为了观察JEV感染后小鼠的免疫反应,本研究通过流式细胞分析了外周血和脾脏中DC,MψCD4和CD8T细胞的比例。结果发现,在未感染时,p53KO小鼠外周血中DC细胞的比例与p53WT小鼠比较没有显著差别,Mφ细胞则要明显低于p53WT小鼠；而在JEV感染后p53KO小鼠外周血中,DC和Mφ比例显著上升,而p53WT小鼠的比例没有显著变化。上述结果说明,p53影响了DC、Mφ的增殖,提示p53可能通过抑制DC和Mφ增殖,限制炎症相关因子的产生；在JEV感染小鼠脾脏中,p53WT的CD4 T细胞显著增殖,但是p53KO小鼠的CD4 T细胞的比例却没有变化。该结果提示p53可能通过调节CD4 T细胞的增殖,参与机体的免疫反应。
　　 5、小鼠脑组织全基因表达谱差异分析。为了探索p53抑制JEV复制及其致病性的机制,筛选潜在受p53调控的并参与JEV感染的基因,我们对小鼠脑组织进行了全基因表达谱分析。通过比较p53WT和p53KO小鼠差异表达基因,我们发现p53KO小鼠脑组织中,一部分炎症相关因子(趋化因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子等)的表达上调,而一些与细胞先天性免疫相关分子表达下调,一些与凋亡相关的基因也有差异表达。另外还发现:JEV感染p53基因沉默细胞后IFITM3的表达减少；在p53KO MEF中过表达p53可以诱导IFITM3的表达:过表达p53或用5-Fu刺激能刺激IFITM3启动子的活性上升。这些结果说明,IFN诱导的抗病毒基因IFITM3可能受到p53的调控。
　　 综上所述,本课题从多方面多层次研究了JEV与p53的相互作用,分析了p53对JEV复制及致病性的影响,发现了一些JEV感染宿主过程中潜在受p53调控的相关分子和免疫细胞,进一步揭示了p53的先天性抗病毒免疫力和JEV的致病机理,为以后进一步研究p53抗JEV的分子机制和开发抗病毒药物提供有价值的数据。