猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白重组抗原及单克隆抗体的制备与鉴定

摘要

PRRSV是引起猪繁殖与呼吸障碍综合征的主要病原,其分为两个血清型:美洲型和欧洲型。美洲型自1995年底以来一直在中国内陆流行,给我国养猪业带来巨大损失。2011年田克恭等报道在中国大陆首次发现欧洲型PRRSV。如何对PRRSV及时有效的鉴定,是减少经济损失,保护畜牧业健康有序发展的前提。由于单克隆抗体较高的灵敏性和特异性,以及其相关操作简单、廉价等特点,所以利用单克隆抗体的诊断方法在疾病的检测中得到广泛的应用。本课题开展了能够同时识别美洲型和欧洲型PRRSV的杂交瘤细胞株的制备及鉴定,为后续检测试剂盒的研发做好铺垫。
　　 本实验利用实验室保存的美洲型PRRSV HPBEDV毒株成功克隆出ORF7基因,并将其成功连接到原核表达载体pET-30a(+)上,转化到BL21(DE3)后进行诱导表达。可溶性分析表明原核表达的融合蛋白是以包涵体的形式存在,复性后western boltting检测证明其具有较好的抗原性。利用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化后的融合蛋白经三次免疫和一次加强免疫Balb／c小鼠后进行融合,经过四次亚克隆和间接ELISA的筛选,最终获得了两株单抗(NA N002和NA N008)。间接ELISA检测证明2株杂交瘤细胞所分泌的McAb特异性良好,并具有较高的稳定性。抗体亚型均为1gG2b。杂交瘤细胞的染色体数目为100和105,腹水纯化后只有抗体的重链和轻链两条链,大小分别为50ku和25ku。抗体效价:NA N002为1:40960,NA N008为1:20480。特异性检测发现所制备的这两株单抗能够同时识别PRRSV两种血清型,而不与FMDV,CSFV和PCV发生交叉反应,显示了良好的特异性。非标记ELISA相加实验证明两株单抗识别的为同一抗原位点。ORF7分段表达后发现这两株只与ORF7的上半段发生反应。后经序列比对和相关文献报道将抗原位点初步定位于25-30aa,和51-58aa。