马耳他型布氏杆菌弱毒疫苗株M5-90致弱分子机制的研究

摘要

布病尤其是由B.melitensis感染所致,仍然是目前世界上最重要的一种人畜共患病,每年大约有50多万病例报道。迄今为止,采用多种方法开发和研究防控布病的疫苗,但是还没有一种安全有效的疫苗能应用于人的布病防控,当前的主要疫苗均对人有一定致病性。B.melitensis M5-90系我国自行分离培养的弱毒疫苗株,具有较好的安全性及免疫保护力,为我国布病防控发挥了重要作用,但其致弱的分子机制还不甚清楚。为研制更加安全、有效的布氏杆菌疫苗,迫切需要加强对布氏杆菌病病原致病分子机制与免疫机制的基础研究。
　　 Ⅰ.马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90致弱分子机制的研究
　　 在完成M5-90及其亲本强毒株M28的全基因组测序基础上,通过系统基因组比对,并结合比对亲缘关系最近的强毒国际参考株B.melitensis16M和ATCC23457,共筛选到23个毒力相关基因(OCDs)。其中差异最显著的是延伸因子EF-Tu(BM28_A1261),在M5-90编码区出现50处SNPs和9处Indels,占整个基因组差异的30％。2-D DIGE分析实验室条件下培养的M28和M5-90全细菌蛋白(pH范围4.0-7.0)表达差异,共鉴定到24个差异显著蛋白,7个为M5-90高表达,其余17个为M28高表达。这是第一次关于人工致弱的强、弱亲本毒株间基因组学和比较蛋白组学分析。结果发现,DNA／RNA合成代谢,营养吸收利用和细胞外膜合成或外膜蛋白等相关基因变异在M5-90的致弱过程中起到了重要作用。在此基础上,首先选择基因组上突变最为集中的tuf-2(BM28_A1261)基因作为重组靶位点,以M28和M5-90为亲本,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为筛选标记,构建tuf基因缺失突变株；成功构建了突变株M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2。M90-tuf2和亲本株M5-90不论在生长特性还是对小鼠毒力上都无显著差异；M28-tuf1、M28-tuf2对小鼠致病力明显减弱(p<0.01),但仍比疫苗株强(p<0.01)。M28-tuf1致病力略高于M28-tuf2,差异不显著；通过小鼠感染模型证实tuf是M5-90致弱的重要基因,但不是唯一因素,tuf-2在M5-90致弱中的起到重要作用。
　　 Ⅱ.马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90致弱免疫机制研究
　　 布氏杆菌是一种胞内寄生菌,巨噬细胞是布氏杆菌体内侵袭的主要目标细胞。M5-90及其强毒亲本株M28致病力显著差异,研究二者与宿主相互作用差异,有助于与理解M5-90致弱的免疫机制。本研究,利用数字表达谱DGE技术分析鼠腹膜巨噬细胞感染M28和M5-904 h后转录组的变化,共计鉴定出1019个DEGs。发现多个显著性差异信号通路,如溶酶体和SNARE胞内运输通路。首次分析了强弱毒布氏杆菌感染组间DEGs,并对显著性差异代谢通路DEGs构建蛋白相互作用网络(Singal-Net)。网络中关键基因多为细胞凋亡相关基因,如Mapk3、Traf6、Chuk、Kras、Jak1和Ptpn6等。这些基因及其参与的信号转导过程体现了强弱菌株侵染宿主细胞的主要差别,其结果是弱毒株M5-90抗溶酶体消化及抗细胞凋亡能力弱于强毒株M28,导致宿主细胞内生存能力的下降或存活时间的缩短。这些数据有利于深入理解M5-90的致弱分子免疫机制。