牛筋草(Eleusine indica(L.)Gaertn.)对草甘膦的抗药性

摘要

牛筋草(Eleusine indica(L.) Gaertn.)是一种分布广泛的恶性杂草。草甘膦是一种优良的灭生性除草剂。在我国部分常年、高频施用草甘膦的地区，牛筋草种群难以防除，对农业造成严重损失。本研究明确了部分牛筋草种群对草甘膦的敏感性水平，并探索了其抗性机制。主要结论如下:
　　1.草甘膦剂量1680 gaeha-1处理各种群后第10天，种群BY1、SL1、SL2与SL5植株叶片的叶绿素相对含量(16.4-28.0)显著高于敏感种群XD1(1.5);种群BY1、SL1、SL2与SL5植株体内的莽草酸含量(188.3-858.1μg g-1)显著低于敏感种群XD1(3228.2μg g-1)。草甘膦剂量1680 gaeha-1处理各种群后14天，敏感种群(XD1、BY3)的死亡率为100％，而种群SL1与SL5的死亡率低于30％。被测12个种群的抗性指数范围为1.8-5.1。
　　2.种群R1(BY1)植株的EPSPS序列中，102位苏氨酸(T)与106位脯氨酸(P)分别被异亮氨酸(I)和丝氨酸(S)所取代。种群R2(BY2)中106位脯氨酸(P)被亮氨酸(L)所取代。种群R3(SL1)的EPSPS序列与敏感种群一致。种群R1中，抗性植株均为杂合子。其中6.7％的植株基因型为Rr，26.7％为R/WT，本种群有三种等位基因1021-106S(R)、T102-106S(r)、T102-P106，发生频率分别为16.7％，3.3％和80.0％。种群R2中，40.0％的植株为纯合子，20％为杂合子。此种群有两种等位基因T102-106、T102-P106，其发生频率均为50％。
　　3.草甘膦对种群R1、R2自交F2代的GR50值分别为1551.5 gaeha-1和1383.7 gaeha-1，抗性指数分别为5.6与4.9;草甘膦浓度为0μM时，种群R1、R2、S的EPSPS离体酶活在0.07-0.13μmolμg-1 protein min-1之间。草甘膦浓度为50μ.M时，种群S的酶活受到显著抑制，而种群R1与R2则无显著变化;原核表达实验中，当M9培养基中草甘膦浓度为20 mM时，4种大肠杆菌的浓度顺序为PE-R1＞PE-R2＞RE-R3＞PE-S。以上结果证明靶标基因突变是种群R1、R2对草甘膦产生抗性的机制之一。
　　4.种群R3植株的EPSPS表达量显著高于其他种群（7-10倍），其相对拷贝数(89.1)显著高于其他种群(2.2-3.6)，而且，其EPSPS酶活是敏感种群S的5.6倍。这证明R3种群EPSPS的过量表达是其对草甘膦产生抗性的机制之一。
　　5.基于illumina技术测序平台，得到过滤数据24597462条。通过组装拼接得到84531(＞200 bp)条转录本，其平均长度为1235 bp，得到48852条单一序列(Unigenes)。其中GO注释的基因数目为21957，分为56个代谢分枝。KOG注释的基因数目为9685，分为26个组。通过注释基因的差异表达分析，筛选出表达差异基因3059条。利用荧光定量PCR的方法验证了EPSPS、PFK、PPDK、PRKB的表达。
　　本研究明确了广州、成都两地部分牛筋草种群对草甘膦的抗性水平;明确了靶标突变及其过表达是其产生抗性的重要机制。其中单突变(P106L)与靶标扩增的抗性机制均在牛筋草中首次发现;本研究利用高通量测序技术筛选出了与牛筋草光合作用、碳代谢及解毒作用相关的重要抗性基因，发现其抗性的产生是多种代谢方式系统作用的结果。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 草甘膦及其应用

1．1．1 草甘膦简介

1．1．2 草甘膦应用现状

1．2 抗草甘膦杂草现状

1．3 杂草抗草甘膦机制研究现状

1．3．1 EPSPS突变

1．3．2 EPSPS扩增

1．3．3 减少草甘膦的吸收与转导、解毒作用

1．3．4 隔离作用

1．4 牛筋草的研究现状

1．4．1 牛筋草的生物学特征

1．4．2 牛筋草的分布与危害

1．4．3 牛筋草对草甘膦的抗药性现状

1．5 本研究的目的与意义

第二章 牛筋草不同种群对草甘膦的抗药性水平测定

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 研究方法

2．2 结果与分析

2．2．1 整株植物测定

2．2．2 草甘膦处理后莽草酸与叶绿素相对含量的变化

2．3 讨论

第三章 牛筋草EPSPS核苷酸多态性分析及其功能验证

3．1 牛筋草EPSPS核苷酸多态性分析

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 结果与分析

3．2 牛筋草EPSPS的功能验证

3．2．1 自交F2代对草甘膦的敏感性验证

3．2．2 不同突变方式EPSPS离体酶活检测

3．2．3 不同突变方式植株莽草酸含量的检测

3．2．4 原核表达验证不同突变EPSPS对草甘膦的耐受性

3．3 讨论

3．3．1 牛筋草EPSPS核苷酸多态性分析

3．3．2 牛筋草EPSPS的功能验证

第四章 牛筋草EPSPS的相对表达量检测

4．1 材料与方法

4．1．1 材料的准备

4．1．2 内参基因克隆与筛选

4．1．3 牛筋草EPSPS定量表达测定

4．1．4 牛筋草EPSPS拷贝数测定

4．1．5 数据处理方法

4．2 结果与分析

4．2．1 最适内参基因的筛选

4．2．3 不同种群牛筋草EPSPS相对表达分析

4．2．4 不同种群牛筋草EPSPS相对拷贝数分析

4．3 讨论

4．3．1 内参基因克隆与筛选

4．3．2 牛筋草EPSPS的相对表达

第五章 DGE测序挖掘牛筋草抗性相关基因

5．1 DGE测序及分析

5．1．1 材料与方法

5．1．2 文库构建及测序

5．1．3 数据分析方法

5．1．4 结果与分析

5．2 与抗性相关候选基因的FQ-PCR验证

5．2．1 与抗性相关的重要基因的筛选

5．2．2 重要基因的克隆

5．2．3 重要基因的FQ-PCR验证

5．3 讨论

第六章 全文结论

参考文献

附图

致谢

作者简历