藏猪高海拔环境适应性分子机制探讨

摘要

藏猪是生活在我国青藏高原地区的古老地方猪种，对高海拔恶劣环境具有良好的适应能力。藏猪良好的环境适应性是长期人工及自然选择作用下形成的，其遗传学机理非常复杂，需要多个基因协调发挥作用。本研究采用猪的全基因组SNP芯片对生活在高海拔地区的藏猪（3000米）、中等海拔高度的大河猪（2000米）以及平原地区的五指山猪（200米）进行分型。基于群体遗传学原理对生活在高原地区的猪种与平原猪种高度分化的基因组区域进行扫描，对显著差异的拷贝数变异区域进行鉴定并运用基于单体型的logistic回归模型对藏猪基因组中的基因互作模式进行探索，同时采用RNA-seq技术对藏猪和平原猪（东北民猪）肺部基因表达模式进行比较，从四个不同的角度系统的理解藏猪高海拔环境适应性的分子机制。
　　通过比较藏猪、大河猪与五指山猪基因组上的高度分化区域，共鉴定了12个(CCBE1，F2RL1，AGGF1，ZFPM，IL2，FGF，PLA2G4A，ADAMTS9，NRBF2，MJD1C，VEGFC昶ADAM19)藏猪特异、6个（OGG1，FOXM, FLT3，RTEL1，CRELD1和RHOG）大河猪特异，以及6个（VPS13A，GNA14，GDAP1，PARP8，FGF10和ADAMTS16)两个猪种共同的适应性基因。功能分析表明藏猪特异性适应性基因主要涉及心血管系统的发育，大河猪特异性的适应性基因主要涉及DNA氧化损伤修复，而二者共同的适应性基因则主要参与血液循环、DNA修复和能量代谢等过程。
　　对生活在不同海拔高度的三个猪品种基因组的拷贝数变异区域进行分析发现，拷贝数变异区域与不同猪种间高度分化的基因组区域没有重叠，表明拷贝数变异主要发生在中等或小程度分化的基因组区域。5个与稳态过程相关的基因，包括CIDEA、ABCG1、IL6ST以及两个人类的同源基因SLC9A9和NHLRC2，所在的拷贝数变异区域在品种间存在差异，可能与高原猪种高海拔环境适应性相关。这些基因的功能主要涉及温度适应、能量代谢、低氧应答、肺部功能及心血管系统发育。
　　以藏猪和五指山猪为研究材料对全基因组两两非关联位点进行互作检测，共筛选到5,834对显著的基因互作对子(FDR＜0.001)，FST分析表明这些基因大都处于低等或中等程度分化。以此构建基因互作网络并对网络拓扑结构进行分析，结果表明该互作网络具有“小世界”和“无标度”两个生物网络的标志性特征。同时，基于泊松分布共检测到87个高连通度的hub基因，功能分析表明其中的13个(ADRB1，RFC3，CDK7，NRG1，ISL1，RAG2，FLT1，NOX，NDUFA12，SCNN1B，TGFBI, MYC和CDCP)具有与高海拔环境适应性相关的功能。前期生物学实验表明这13个基因中的8个（NOX4，TG FB1，CDCP1，FLT1，MYC，CDK7, RFC3和NGR1）都参与机体内最重要的氧浓度调节通路-缺氧诱导因子通路。
　　对藏猪和民猪肺部转录组研究共检测到了281个差异表达基因，其中191个基因(67.97％)在藏猪肺部表达下调，而只有90个基因(32.08％)在藏猪肺部表达上调。表明高海拔环境中，大部分基因的表达被抑制。对上调的基因进行功能富集分析，发现藏猪中上调表达的基因主要涉及肺组织发育、血管系统以及炎症反应，表明藏猪很可能通过这些基因的下调与上调维持着肺部及血管的损伤与修复之间的平衡。同时，将差异表达基因与藏猪基因组上正选择区域进行比较分析，只发现了6个共同基因(RGS2，SCD, TLE2，SLCO4C1，CXCL13和PRCP基因)，表明差异表达的基因并不是完全由正选择作用到基因的顺式作用元件上驱动的，有可能是通过反式作用方式进行调节或者是通过改变蛋白质结构发挥作用的。同时，这6个基因几乎都具有与高海拔环境适应性相关的功能，可作为候选基因进行更深入的研究。而对正选择基因的表达量进行分析表明这些基因的表达变化度都较小，提示是微效基因作用形式。
　　综上，藏猪高海拔环境适应性机制十分复杂，涉及大量基因。这些基因大部分属于微效基因，其中与低海拔猪种高度分化的基因可能主要通过改变蛋白质结构或通过反式作用方式影响其他基因的表达;而很多中等甚至低程度分化的基因，例如HIF通路基因，则可能通过与其他基因互作以生物网络的方式影响藏猪高海拔环境适应性特征，部分低程度分化基因（如稳态过程相关基因）则可能通过改变拷贝数发挥作用。在高原环境下，藏猪肺部大部分基因的表达被抑制，但与肺部组织发育、血管系统以及炎症反应相关的部分基因表达上调，从而维持肺部和血管在高海拔极端环境中的损伤与修复之间的平衡。

目录

论文说明

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 高海拔环境适应性的生理基础

1．2 高海拔环境适应性研究的分子策略

1．2．1 通过分析单个基因组序列进化寻找适应性基因

1．2．2 基于群体遗传学策略寻找正选择基因

1．2．3 基于基因表达谱的研究

1．2．4 基于候选基因的研究

1．3 高海拔环境适应性相关的主要基因

1．4 基因互作与环境适应性

1．5 本研究立题思路

第二章 藏猪、大河猪海拔适应性选择信号扫描

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 基因组DNA提取及浓度检测

2．2．4 SNP基因型判定

2．3 芯片数据处理与分析

2．3．1 SNP及样本的质量控制

2．3．2 群体结构分析

2．3．3 选择信号扫描

2．3．4 受选择区域确定及基因注释

2．4 结果与分析

2．4．1 数据质控结果

2．4．2 群体结构分析结果

2．4．3 连锁不平衡衰减分析结果

2．4．4 连续性纯合片段分析结果

2．4．5 选择信号分析

2．4．6 猪EPAS1基因外显子多态性研究

2．5 讨论

第三章 拷贝数变异与高原猪种拔环境适应性相关性探讨

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 样本个体CNV的推断

3．3．2 qPCR验证

3．3．3 与以往报道的比较

3．3．4 与高原环境适应性相关的CNV挖掘

3．4 讨论

第四章 藏猪全基因组基因互作检测

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 研究方法

4．3 结果与分析

4．3．1 非关联SNP检测结果

4．3．2 全基因组SNP互作检测

4．3．3 互作网络分析

4．3．4 关键基因的确定以及与高海拔环境适应性的关系

4．4 讨论

第五章 藏猪-平原猪肺部基因表达谱比较分析

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验动物及样本采集

5．2．2 总RNA提取

5．2．4 RNA-seq建库及测序

5．2．5 转录组测序

5．2．6 数据处理及分析

5．3 结果与分析

5．3．1 RNA提取与质量检测

5．3．2 RNA-seq原始测序数据质量控制

5．3．3 基因组mapping结果

5．3．4 基因表达水平分析

5．3．5 基因表达差异分析

5．3．6 差异基因表达模式聚类分析

5．3．7 基因差异的功能富集分析

5．3．8 藏猪中上调表达基因的功能分析

5．3．9 表达差异基因与甘肃藏猪基因组选择区域比较

5．3．10 正选择基因表达变化水平研究

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历