木质部难养菌(Xylella fastidiosa)基因组分析及特异性分子检测

摘要

木质部难养菌(Xylella fastidiosa)是革兰氏阴性、营养需求复杂、在木质部生长并且依靠昆虫介体传播的植物病原细菌。该菌的寄主范围很广，能侵染超过30个科的植物，包括单子叶和双子叶植物。该病原菌可以引起重要的农业经济作物病害，如葡萄皮尔斯病和柑橘杂色萎黄病等。X.fastidiosa也引起许多重要的木本观赏植物的细菌性叶灼病，如桑树、梧桐树、夹竹桃等。目前侵染这些木本观赏植物菌株的基因组序列很有限，能够区分、鉴定和检测这些菌株的分子诊断方法也鲜有报道。本论文针对侵染木本观赏植物的X.fastidiosa菌株，测定了其基因组草图，并以此开发了基于基因组的分子检测方法，为了解该菌的流行学和病因学提供有力的工具。
　　1.测定了木质部难养菌桑树和梧桐树菌株的基因组草图。利用Roche454GS对引起桑树叶灼病和梧桐树叶灼病的X.fastidiosa菌株进行基因组序列测定。所得序列经过拼接组装及注释后提交到NCBI发表。测序结果显示Mul-MD基因组长度为2，543，372 bp，GC含量为51.65％，共有2，286个蛋白编码基因。Sy-VA基因组长度为2，477，829 bp，GC含量为51.64％，共有2，231个蛋白编码基因。此外，Mul-MD和Sy-VA基因组还分别含有一个约25 kb和约26kb的质粒。Mul-MD的质粒与另外4个美国加州的桑树细菌性叶灼病菌株的质粒相似。
　　2.建立了木质部难养菌夹竹桃菌株的实时荧光定量PCR检测方法。通过比对现有X.fastidiosa基因组核酸序列，得到特异性的DNA片段。根据特异性片段设计并筛选对引起夹竹桃叶灼病的菌株具有特异性的实时荧光定量PCR引物和探针。使用该引物和探针对X.fastidiosa菌株的菌液或者基因组DNA进行检测，结果显示该引物和探针只能识别夹竹桃菌株，不识别其它的X.fastidiosa菌株和亲缘关系较近的外源细菌。该检测方法在病菌DNA和带菌植物上的检测限为每个反应10.4 fg DNA。该引物对还可以与其它X.fastidiosa菌株特异性引物组合成多重实时荧光定量PCR来鉴定和定量植物和昆虫样品中的特定X.fastidiosa菌株，有利于病因学和流行学的研究，进而完善对该菌引起病害的管理和防治。
　　3.建立了木质部难养菌桑树菌株的常规PCR检测方法。根据桑树菌株基因组序列发现一个在北美和南美地区所有基因组测序的X.fastidiosa菌株范围中，桑树菌株特有的开放阅读框。在此特有的开放阅读框的基础上，设计并验证了两组对桑树菌株特异性的引物。这两组引物可以特异性的检测和鉴定在培养基和植物样品中的木质部难养菌桑树菌株。而且，在测试来自与桑树样品同一区域的橡树、榆树和梧桐样品时，没有任何混合侵染或者非特异性检测结果出现。该基因型特异性PCR检测方法对X.fastidiosa引起的细菌性叶灼病的诊断、菌株特异性寄主和昆虫介体的研究，以及病害综合防治有极大价值。另外，本研究发现，在意大利引起橄榄树急性坏死病(CoDiRO)的X.fastdiosa菌株的基因组最近被报道，该基因组中也含有美国境内桑树菌株的特异性开放阅读框。因此，这两组引物也可用于意大利境内橄榄树菌株的特异性检测和鉴别，为进一步了解X.fastidiosa的生物学特性及进化关系提供依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 前言

1．1 Xylella fastidiosa引起的病害和症状

1．2 X．fastidiosa的生物学特性

1．2．1 菌落和细胞形态

1．2．2 发生与传播

1．3 X．fastidiosa的分类现况

1．4 X．fastidiosa的基因组研究进展

1．4．1 X．fastidiosa基因组测序进展

1．4．2 X．fastidiosa比较基因组学研究进展

1．5 X．fastidiosa的分子检测方法

1．6 本研究的目的、意义及技术路线

1．6．1 本研究的目的及意义

1．6．2 技术路线

第二章 木质部难养菌桑树和梧桐树菌株的基因组测序

2．1 材料和方法

2．1．1 供试菌株

2．1．2 菌株的分离和保存

2．1．3 菌株的致病性验证

2．1．4 基因组DNA的提取

2．1．5 测定和组装基因组序列

2．1．6 测定基因组序列中的Gap

2．1．7 提交基因组序列

2．2 结果与分析

2．2．1 菌株的分离

2．2．2 菌株致病力验证

2．2．3 测定和组装基因组序列

2．2．4 基因组序列的提交

2．3 讨论

第三章 木质部难养菌夹竹桃菌株的TaqMan荧光定量PCR检测

3．1 材料和方法

3．1．1 供试菌株及培养方法

3．1．2 夹竹桃植物样品和ELISA

3．1．3 DNA提取和常规PCR条件

3．1．4 特异性DNA序列的筛选和特异性引物及探针的设计

3．1．5 Real-time PCR反应条件和标准曲线的建立

3．2 结果与分析

3．2．1 特异性序列的鉴定和特异性引物以及探针的设计

3．2．2 Real-time PCR反应条件和标准曲线的建立

3．3 讨论

第四章 美国境内木质部难养菌桑树菌株的PCR特异性检测

4．1 材料和方法

4．1．1 供试菌株

4．1．2 细菌基因组DNA提取

4．1．3 植物样品的DNA提取

4．1．4 筛选和鉴定特异性序列

4．1．5 PCR测试条件

4．2 结果与分析

4．2．1 筛选和鉴定特异性序列

4．2．2 PCR引物的特异性测定

4．2．3 PCR产物有效性的确认

4．2．4 PCR检测方法稳定性测试

4．3 讨论

第五章 全文结论

5．1 测定了木质部难养菌两个菌株的基因组序列，并对其基因组进行了注释

5．2 建立了木质部难养菌夹竹桃菌株的实时荧光定量PCR检测方法

5．3 建立了木质部难养菌桑树菌株的常规PCR特异性检测方法

后续工作展望

参考文献

附录

致谢

作者简介