拟南芥组蛋白去乙酰化酶基因家族分析及AtSRT2在盐胁迫下调控种子萌发的分子机制

摘要

近年来，随着表观遗传学研究的发展，人们发现DNA甲基化及组蛋白甲基化等表观遗传学修饰在植物生长发育及逆境胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。然而，目前对组蛋白乙酰化修饰的生物学功能及其调控方式缺乏系统深入的研究。本研究以参与维持体内组蛋白乙酰化平衡状态的拟南芥组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）为研究对象，对其基因家族的系统进化、基因组结构、组织表达特异性、对激素和胁迫处理的应答模式及突变体表型特征进行系统分析，以期对组蛋白乙酰化修饰的生物学功能有更深入的了解。
　　同时，人类Sirtuin类组蛋白去乙酰化酶在染色质沉默、DNA损伤修复、细胞周期调控和自噬等过程发挥着极其重要的功能，而关于植物Sirtuin类蛋白生物学功能的报道不多。因此，本研究重点针对拟南芥其中一个Sirtuin类蛋白成员，AtSRT2介导的生物学功能及其作用机制进行了深入的研究。
　　主要获得以下研究结果:
　　1.拟南芥组蛋白去乙酰化酶基因家族特性，基因表达模式及生物学功能分析。对拟南芥组蛋白去乙酰化酶基因（AtHDACs）家族进行系统进化树分析，结果表明AtHDACs可以分为三大类。AtHDACs基因结构中含有大量的内含子，个数多分布在5个以上。AtHDACs不均匀的分布在拟南芥5条染色体上，分布最多的是3号和5号染色体。组织特异性表达分析结果表明，AtHDACs主要在叶片、荚果和种子中高量表达;AtHDACs在激素和胁迫处理下，其表达量不会发生急剧的变化，上下调比例维持在-1.49～3.1。拟南芥突变体表型研究结果表明，与野生型相比较，突变体主要表现为叶形态、花形态和花期异常。
　　2.Sirtuin类蛋白AtSRT2参与植物高盐胁迫下种子萌发的调控过程。AtSRT2基因突变体srt2在正常条件下，表型与野生型一致，但在高盐条件下，srt2表现出对高盐胁迫敏感。AtSRT2有7个可变剪接体，其中AtSRT2.7在种子中表达量最高，并且受盐胁迫诱导表达，在srt2背景下过表达AtSRT2.7，srt2盐敏感表型部分恢复。这表明AtSRT2.7参与了植物盐胁迫下种子萌发的调控。
　　3.AtSRT2通过减少盐胁迫下植物基因组的损伤及NAD+含量的积累调控种子的萌发。单细胞凝胶电泳(SCGE)实验表明，在种子萌发过程中，盐胁迫诱导了植物基因组的损伤，且srt2的基因组损伤较野生型更为严重。与野生型比较，srt2对DNA损伤诱导剂甲基磺酸甲酯(MMS)处理更为敏感。另一方面，种子萌发实验表明，NAD+处理可抑制种子萌发，而且srt2对外源NAD+处理较野生型更为敏感。检测发现，在种子萌发过程中，盐胁迫诱导srt2体内NAD+含量积累。这表明DNA损伤和NAD+积累是造成srt2对盐敏感的原因。
　　4.AtSRT2通过调控下游盐胁迫相关基因AtVAMP714启动子区组蛋白H4K8位点的乙酰化水平影响植物种子萌发期的耐盐性。AtSRT2.7定位在植物的细胞核和细胞膜上。与野生型比较，srt2组蛋白H4K8位点乙酰化水平升高。体外酶活实验表明，AtSRT2.7是一种NAD+依赖型的组蛋白去乙酰化酶，特异地对H3K9、H3K14、H4K8三个位点进行去乙酰化。在盐胁迫处理下，野生型种子萌发过程中12～48h有明显的H4K8去乙酰化过程，而srt2组蛋白H4K8位点乙酰化水平高于野生型。这些结果说明AtSRT2.7通过H4K8乙酰化水平的调控介导盐胁迫下的种子萌发过程。ChIP-Seq和ChIP-qPCR结果表明，在盐胁迫下，AtSRT2通过降低盐胁迫相关基因AtVAMP714启动子区组蛋白H4K8位点的乙酰化水平，抑制AtVAMP714的表达，从而减少H2O2对植物体液泡膜的损伤，缓减盐胁迫对种子萌发的影响。
　　以上研究结果表明，拟南芥组蛋白去乙酰化酶广泛参与了植物生长发育和逆境应答过程，且不同的组蛋白去乙酰化酶行使功能不同，表现出调控机制的复杂性。其中，Sirtuin类组蛋白去乙酰化酶AtSRT2通过调控组蛋白H4K8位点的乙酰化水平调控盐胁迫下的种子萌发过程，并主要通过减少盐胁迫下植物DNA的损伤以及NAD+的积累行使基因功能。通过本研究增加了我们对植物组蛋白去乙酰化基因家族特性及功能的了解，为进一步揭示植物表观遗传学调控网络创造了条件。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 组蛋白乙酰化修饰

1．2 组蛋白乙酰化的生物学功能

1．2．1 组蛋白乙酰化与核小体装配

1．2．2 组蛋白乙酰化与染色体结构

1．2．3 组蛋白乙酰化与异染色质的形成

1．2．4 组蛋白乙酰化与转录水平的调控

1．2．5 非组蛋白乙酰化水平的调控

1．3 种子萌发的调控

1．3．1 植物激素对种子萌发的调控

1．3．2 光照对种子萌发的影响

1．3．3 细胞修复与种子萌发

1．3．4 组蛋白修饰与种子萌发

1．3．5 盐胁迫与种子萌发

1．4 研究目的与意义

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 菌株和质粒

2．2 试剂

2．2．1 限制性内切酶

2．2．2 PCR试剂

2．2．3 抗体

2．2．4 蛋白纯化

2．2．5 其它生化试剂

2．3 试验方法

2．3．1 RNA提取与cDNA反转录

2．3．2 AtSRT2基因的扩增及纯化

2．3．3 克隆载体的连接及转化

2．3．4 拟南芥AtSRT2基因过表达株系

2．3．5 拟南芥突变体鉴定

2．3．6 原生质体亚细胞定位

2．3．7 实时荧光定量PCR

2．3．8 蛋白表达和纯化

2．3．9 组蛋白去乙酰化酶活检测

2．3．10 Western blotting

2．3．11 表型鉴定

2．3．12 NAD+含量测定

2．3．13 单细胞凝胶电泳(SCGE)

2．3．14 ChIP实验

2．3．15 AtSRT2进化分析

第三章 拟南芥组蛋白去乙酰化酶基因家族分析

3．1 HDACs系统进化分析

3．2 拟南芥组蛋白去乙酰化酶家族基因结构分析

3．3 拟南芥组蛋白去乙酰化酶染色体定位

3．4 拟南芥组蛋白去乙酰化酶组织特异性表达模式

3．5 拟南芥组蛋白去乙酰化酶对生长发育的调控

3．6 拟南芥组蛋白去乙酰化酶对激素和非生物胁迫处理的响应

第四章 AtSRT2对盐胁迫下种子萌发的调控

4．1 srt2突变体的鉴定

4．2 srt2在种子萌发期对盐敏感

4．3 AtSRT2．7参与了盐胁迫下种子萌发的调控

4．4 AtSRT2．7具有核定位信号

4．5 AtSRT2．7通过H4K8去乙酰化调控盐胁迫下种子萌发的过程

4．6 盐胁迫响应基因AtVAMP714的表达受H4K8乙酰化调控

4．7 srt2盐敏感表型与DNA损伤相关

4．8 srt2盐敏感表型与NAD+代谢相关

第五章 讨论

5．1 AtSRT2的可变剪接体

5．2 AtSRT2参与盐胁迫下种子萌发过程与ABA信号调控途径

5．3 AtSRT2参与盐胁迫下种子萌发过程与NAD+代谢的关系

5．4 不同组蛋白乙酰化修饰位点的生物学功能

5．5 非组蛋白乙酰化修饰

5．6 AtSRT2对盐胁迫下种子萌发过程的调控模式

第六章 全文结论

参考文献

附图

致谢

作者简历