大白菜细胞核复等位雄性不育基因定位

摘要

大白菜（B.rapa L.ssp.pekinensis）是我国重要的蔬菜作物，存在显著的杂种优势，雄性不育系是杂种一代种子生产中应用的主要手段之一。大白菜复等位基因雄性不育遗传机理的提出为雄性不育的利用开辟了一条新途径。但是在转育过程中，通过表型进行基因型判定十分复杂且周期长。利用分子标记辅助选择(MAS)可加快选育速度。
　　本试验利用大白菜复等位雄性不育材料“939A”构建F2分离群体，研究位于A08染色体上的复等位雄性不育基因，通过基于重测序的全基因组杂合度分析及传统BSA法标记筛选对该基因进行初定位及精细定位，并对候选区域进行初步筛选。主要结果如下:
　　1.群体Ⅰ为939A与YDQ56A杂交得到的F1S4姐妹交群体，分离比符合3∶1，是一个隐性雄性不育系;群体Ⅱ为939A与yellow sarson杂交，F1代不育，说明yellow sarson育性基因型为保持基因msms，但表现为环境敏感型，后期随温度升高，F1代侧枝开花并产生微量花粉，花粉活力鉴定为有活性。F2代884个单株中可育株198株，不育株686株，卡方检验符合1∶3(x2=3.1916＜x20.05=3.84)，说明F2代群体符合单基因显性遗传规律，但其中亦出现环境敏感型单株。
　　2.初定位利用两种不同的方法:传统BSA分子标记筛选和基于全基因组杂合度分析的基因定位方法。全基因组杂合度分析定位基因法利用SNP-index值作为标准，衡量两亲本基因对两池内基因频率的贡献，最终将不育基因Ms定位于A08染色体末端19，250,000-21，670，000的范围内。
　　3.分子标记筛选同时利用群体Ⅰ和群体Ⅱ。BSA在群体Ⅰ不育池及可育池间共筛选了88对InDel引物，发现3对多态性InDel标记，分别位于不育基因两侧，最近遗传距离2.5 cM;群体Ⅰ中有多态的三对标记在群体Ⅱ中验证均没有多态性。在群体Ⅱ的不育池及可育池间共筛选位于A08染色体上的265对InDel引物和28对SSR引物，发现8对标记与不育基因Ms紧密连锁，距离最近的两侧标记为SSR60514及Br19747979，最近遗传距离1.6 cM，两标记间遗传距离5.8cM，物理距离387.5kb。通过序列比对，该区间位于群体Ⅰ定位的两端标记BrID111035、A081900之间，群体Ⅰ和群体Ⅱ定位结果一致。
　　4.利用重测序数据，在初定位外侧标记的804kb范围内设计22对SSR及42对InDel引物。可育池及不育池间筛选多态性标记，并在群体Ⅱ前297株中验证标记多态性。结果在初定位最近两侧标记S SR60514和Br19747979之间，发现5对InDel与Ms紧密连锁，加密后最近两侧标记为Br19499732与Br19553530，距离Ms的遗传距离分别为0.7cM和1.3cM，两标记间物理距离53.8kb。5.在群体Ⅱ全部884个单株中筛选位于Ms上、下游较远的标记Br19470306和Br19625857，获得重组单株共52株。统计52株重组单株在与目标基因Ms连锁的10个标记中的多态性，利用重组分析对单株逐个分析。结果表明，重组单株分析与Joinmap软件计算结果所在区域一致，Ms位于标记Br19499732和Br19553530间53.8kb范围内，其中包含12个基因。根据基因组注释信息、TAIR和KEGG2数据库信息分析预测Ms可能在Bra016849、Bra030803、Bra030805中。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 绪论

1．1 雄性不育的起因及类型

1．1．1 雄性不育的起因

1．1．2 雄性不育类型

1．1．3 芸薹属雄性不育类型

1．2 芸薹属作物雄性不育在细胞水平的研究

1．2．1 芸薹属作物雄性不育系花器官形态特征

1．2．2 芸薹属作物雄性不育系雄蕊及花粉败育的细胞学研究

1．3 芸薹属作物花粉发育分子水平的研究进展

1．3．1 拟南芥中雄蕊发育相关基因

1．3．2 甘蓝中雄性不育连锁标记

1．3．3 大白菜中雄性不育连锁标记

1．3．4 基因定位新方法

1．4 研究目的意义与技术路线

1．5 技术路线

第二章 大白菜雄性不育性状调查及遗传分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 表型调查

2．1．3 显微镜观察花药内部微观结构及花粉活性

2．2 结果与分析

2．2．1 可育与不育判断标准的确定

2．2．2 花粉内部微观结构及花粉活性检测

2．2．3 大白菜雄性不育遗传规律分析

3．3 讨论

3．3．1 大白菜雄性不育遗传分析

第三章 大白菜雄性不育基因初定位

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 混池单株挑选

3．1．3 混池提取全基因组DNA

3．1．4 建库测序

3．1．5 测序数据处理

3．1．6 DNA提取及分离群体分组分析(BSA)

3．1．7 不育基因连锁标记的筛选及遗传图谱的构建

3．2 结果与分析

3．2．1 全基因组上的杂合度分析

3．2．4 分子标记法对大白菜雄性不育基因初定位

3．3 讨论

3．3．1 基于杂合度分析的重测序法快速定位目标基因

3．3．2 分子标记法定位大白菜雄性不育基因

3．3．3 重测序法定位及分子标记定位的比较

第四章 大白菜雄性不育基因Ms精细定位及候选区域确定

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 DNA提取及分离群体分组分析(BSA)

4．1．3 大白菜雄性不育基因标记加密

4．1．4 扩大群体筛选重组单株分析验证定位区域

4．1．5 候选基因的筛选

4．2 结果与分析

4．2．1 大白菜雄性不育基因MS精细定位

4．2．2 扩大群体验证候选区域

4．2．3 候选基因的筛选

4．3 讨论

4．3．1 大白菜雄性不育基因精细定位

4．3．2 转录组数据和重测序数据用于筛选Ms基因

第五章 全文总结

5．1 大白菜雄性不育的遗传分析

5．2 大白菜雄性不育基因初定位

5．3 扩大群体精细定位及候选区域的确定

参考文献

附录

致谢

作者简历

在读期间发表的主要论文