牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单抗制备与表位鉴定及LJ36/14毒株的分离鉴定

摘要

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)可引起牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD)。感染BVDV的牛临床症状表现为精神沉郁、采食量下降、大量流涎、腹泻、口腔黏膜充血溃疡，孕牛表现为流产或产出畸形胎儿或产出持续感染牛，新生犊牛因严重腹泻而死亡。目前 BVDV在世界范围内流行，引起各个国家的高度关注。BVDV也是组织细胞培养及生物制品中最为常见的外源性病毒。根据BVDV5'非编码区(5'UTR)的不同可以分为BVDV-1型和BVDV-2型两个基因型。不同基因型又进一步分为不同的基因亚型。根据接种细胞后能否产生细胞病变，BVDV分为致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)。若怀孕母牛感染NCP型BVDV后，会导致胎儿免疫耐受，胎儿或继续发育或流产，即使顺利产出也会成为持续感染(PI)牛，可持续向外界排毒，成为BVDV主要的传染源。而目前国内尚无商品化的检测试剂和相关疫苗。
　　p80蛋白是BVDV非结构蛋白之一，在瘟病毒属中是一种突变率很低的非常保守的免疫优势蛋白，具有重要的诊断价值。本研究利用原核表达系统，成功诱导表达出p80重组蛋白，免疫印迹表明其具有良好的反应性。利用浓缩的BVDV病毒液免疫6~8周龄Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞在PEG的作用下进行融合，经过纯化的重组p80蛋白包被的ELISA筛选和三次亚克隆后，获得8株稳定分泌针对BVDV的p80蛋白的杂交瘤细胞株，分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11；8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水，效价为1×105-1×107；间接免疫荧光试验(IFA)表明8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性；8株单抗的抗体亚类均为IgM/κ。本研究制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。利用pGEX-6p-1原核表达载体，表达一系列部分重叠的p80蛋白的短肽，通过对表达蛋白进行Western blot分析，初步确定p80蛋白的抗原表位区域位于p80蛋白的446—558位氨基酸。
　　BVDV亚型较多，不同地区流行不同的亚型，给 BVDV的防控带来的巨大挑战。本研究对2014年从黑龙江省发生牛呼吸道传染病的某肉牛场采集的40份鼻拭子进行了病毒分离，成功分离到一株 BVDV，命名为LJ36/14株。病毒鉴定结果表明，分离株在 MDBK细胞不产生细胞病变。用BVDV的p80蛋白的MAb(3G2)进行的间接免疫荧光试验（IFA）表明接种LJ36/14株的细胞显示特异性绿色荧光。病毒滴定其TCID50为105.9/0.1mL。对LJ36/14分离株的5‘端非编码区（5’UTR）和Npro基因进化树分析表明该毒株为一新的基因亚型，定为BVDV1v亚型。
　　综上所述，本研究成功制备了8株BVDV单抗，IFA表明单抗与BVDV具有良好的反应性和特异性，可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。初步鉴定了p80蛋白的抗原表位区域位于p80蛋白的446—558位氨基酸，为BVDV p80蛋白的结构及生物学功能研究奠定了基础。同时，成功分离得到一株BVDV毒株，即LJ36/14，为NCP型，BVDV-1v亚型，该亚型为首次报道，为了解BVDV地理分布和流行情况及BVDV疫苗的制发奠定了基础。

目录

封面

声明

硕士学位论文评语而、答辩委员会签名表

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略表

第一章 引 言

1.1牛病毒性腹泻病毒概述

1.2 BVDV分类及亚型

1.3流行病学

1.4病毒基因组

1.5 BVDV编码的蛋白及功能

1.6 BVDV的检测

1.7 BVDV的疫苗及防控

1.8研究目的和意义

第二章 牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单克隆抗体的制备

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章 p80蛋白抗原表位区域的初步鉴定

3.1材料与方法

3.2 SDS-PAGE和Western blot结果及分析

3.3讨论

第四章 牛病毒性腹泻病毒LJ36/14的分离与鉴定

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历