CMV侵染烟草的细胞学观察及表达谱分析

摘要

烟草是一种以叶片为收获器官的经济作物，CMV是威胁烟叶生产的主要病毒病之一。本研究对大田分离的CMV病毒进行了亚组鉴定，对我国烟草主体CMV抗源抗性遗传进行了分析。并以高抗CMV烟草种质台烟8号和高感种质NC82为试验材料，利用透射电子显微镜，从细胞学方面观察比较了两个不同抗性种质在接种CMV8 d和15 d时细胞超微结构变化及差异，利用转录组测序研究了二者在基因表达水平上对CMV侵染的响应，分析了CMV病毒与烟草互作的机理，主要结果如下：
　　（1）对大田分离的CMV毒源进行了全基因组测序，核酸和氨基酸序列同源性分析表明，其与亚组I标准株系的同源性远高于亚组II，进一步对其RNA35＇端NTR结构和CP基因核酸序列系统进化分析表明所用的毒源属于亚组IB。
　　（2）基于烟草三个CMV抗源（抗88、台烟8号、FC8）分别与感病品种C151杂交得到的F1和F2群体，利用主基因+多基因混合遗传模型对三个主体抗源的抗性遗传规律进行了遗传分析。结果表明抗88和台烟8号的最优模型是E1模型，即抗性受2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制，主基因的遗传率分别为91.91％和68.50%。FC8的抗性由2对加性-显性-上位性主基因控制（B1模型），主基因的遗传率为76.43%。三个抗源的抗性都主要由遗传因素控制，主基因遗传率较高，抗病性状可以在早期进行选择。抗88和台烟8号主基因间的上位性效应以及多基因的加性和显性效应都有助于提高抗性，可以在育种中加以利用；FC8的两个主基因显性效应明显，适合杂种优势利用。
　　（3）对台烟8号和NC82分别接种CMV病毒，于接毒后8 d和15 d取心叶下部的第一片叶进行细胞超微结构观察比较，结果表明CMV侵染对两个种质的细胞超微结构都能够造成破坏，主要包括：膜结构的破损；叶绿体由椭圆形变为不规则的形状，内部基质和类囊体数量减少，片层排列紊乱，部分片层断裂甚至消失；细胞中线粒体数量增加，内部嵴数量的减少甚至空泡化；细胞中嗜锇颗粒数量增加；细胞核中染色质丝凝缩。两个不同抗性种质的的差异主要体现在发病时间和病变程度上，台烟8号细胞发生病变的时间较晚，而且细胞结构病变程度较NC82较轻。台烟8号在接CMV侵染后8 d过氧化物酶体数量增加，15 d时能够观察到细胞质中小囊泡含量增加，这些现象可能与其抗性相关。
　　（4）转录组分析表明，台烟8号接种CMV3d后与对照相比共有1960个基因差异表达，其中上调表达的有1420个，下调表达的有540个，上调基因数量是下调基因的2.63倍。NC82接种CMV3d后与对照相比共有2543个差异表达基因，其中下调2193个，上调350个，下调基因数量是上调基因的6.27倍。台烟8号和NC82接种CMV处理间共有2925个差异表达基因，其中上调表达基因2368个，下调基因557个，上调基因数量是下调基因的4.25倍。GO分析结果表明两个种质接种CMV处理间差异表达基因中注释到分子功能的有848个，其中66.7%具有结合活性，63.9%具有分解活性，3.8%具有转运活性；有718个基因注释到生物学过程，其中69.6%与代谢过程相关，66.0%与细胞过程相关，11.6%与对刺激的响应过程相关；注释到细胞成分的基因有478个，与细胞相关的占77.6%，与细胞器相关的占51.7%，与膜相关的占23.8%。
　　（5）KEGG分析表明，台烟8号接种CMV处理与对照相比有1187个差异表达基因富集到119条通路中，NC82接种CMV处理与对照相比有1530个差异表达基因，富集到116条通路中。这些通路涉及到物质合成和代谢、信号转导、生长发育调控等多个方面。与抗病相关的通路，包括激素信号转导通路、植物-病原物互作通路、苯丙烷合成通路、类黄酮合成通路、过氧化物酶体通路等在两个种质接种 CMV处理后均能被富集到。比较发现两份不同抗性种质在 ABA信号转导通路、JA信号转导通路、植物-病原物互作通路以及过氧化物酶体通路上的差异表达基因表达模式差别比较明显，提示这些通路可能与两份种质的抗性差异相关。

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第一章 引言

1.1 黄瓜花叶病毒

1.2 烟草黄瓜花叶病毒病

1.3 转录组测序

1.4 本研究的目的意义、主要内容及技术路线

第二章 CMV毒源全基因组序列分析及亚组鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 烟草CMV抗源抗性遗传分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 CMV侵染烟草不同抗性种质的细胞学观察

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 CMV侵染烟草不同抗性种质的转录组分析

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 全文结论

6.1 全文结论

6.2 创新点

6.3 工作展望

参考文献

附录

致谢

作者简历