水稻白叶枯病菌中趋化性基因che的表达调控及其功能研究

摘要

环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是一种参与细菌信号转导的小分子第二信使，调控了生物膜、胞外多糖形成、运动性、毒性等许多生理功能。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)全局性转录调控因子Clpxoo作为一种重要的受体蛋白，其cNMP结构域可与c-di-GMP结合、并发生蛋白构象的改变，而其 DNA结合结构域与下游靶基因启动子相结合、调控基因的表达。Clpxoo介导的c-di-GMP信号调控机制参与Xoo多种重要的生理生化过程，对毒性表达起着非常重要的作用。本研究选取了受Clpxoo蛋白正调控的趋化性基因che(PXO_00043)为靶基因，深入探索che基因表达的调控机制及其在Xoo毒性中的功能。取得以下主要研究结果：
　　1.利用5’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法，鉴定了che基因转录启始位点，利用含有GFP报告基因的pPROBE-AT载体，构建了che基因启动子活性检测系统，通过荧光显微镜和流式细胞仪的检测，明确了che基因启动子的活性，发现Clpxoo蛋白是激活che基因所必需的。此外，虽然che基因在XOM2培养基中上调表达，但并不显著受转录调控蛋白HrpX和HrpG的影响。
　　2.分别构建了Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸位点D70、第99位谷氨酸E99和第166位精氨酸R166位点的点突变，并进行了表达和纯化。利用结合等温滴定实验(ITC)，检测了点突变体与c-di-GMP的结合能力。发现R166突变成丙氨酸R166A后，蛋白发生严重降解和稳定性降低的现象；D70突变成丙氨酸D70A后，点突变体完全丧失了与c-di-GMP结合的能力；E99突变成丝氨酸E99S后，点突变体与c-di-GMP结合能力大大减弱。因此，Clpxoo蛋白D70和E99是与c-di-GMP结合的关键氨基酸位点。
　　3.构建了受Clpxoo蛋白调控的趋化性基因che的缺失突变体及其互补菌株，检测了它们对水稻的致病表型。发现che基因缺失影响了Xoo致病性，互补菌株能恢复。表明che基因与Xoo毒性有关。
　　总之，本研究确定了趋化性基因 che的转录起始位点，鉴定了启动子活性；明确了 Clpxoo蛋白对che基因表达的调控作用；阐明了D70和E99是Clpxoo与c-di-GMP结合的两个关键功能位点；发现了趋化性基因che影响了Xoo致病性。

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第一章 绪论

1.1 水稻白叶枯病菌概述

1.2 c-di-GMP信号调控机制

1.3 细菌趋化性

1.4本研究的目的意义和技术路线

第二章che基因启动子的表达及受调控情况

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第三章 水稻白叶枯病菌c-di-GMP受体蛋白Clpxoo关键功能位点的确定

3.1材料和方法

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第四章 水稻白叶枯病菌趋化性基因che功能研究

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

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