嗜盐细菌的分离鉴定与Natranaerobius thermophiles盐适应机制的蛋白质组学分析

摘要

嗜盐菌是首类被人们发现的极端微生物。嗜盐菌由于其独特的对盐环境的适应机制，在多领域都存在着潜在的应用价值，因此对嗜盐菌的研究有着重大的意义。
　　本课题从新疆盐碱湖分离纯化获得了两株嗜盐细菌BZ-SZ-XJ18和BZ-SZ-XJ27。采用多相分类学的方法，从遗传型特征基于16S rRNA基因序列的系统发育分析、DNA G+C mol％含量、DNA-DNA杂交及多位点序列分析，表型特征和生长特性，生理生化特征和细胞化学组分等多方面对菌株BZ-SZ-XJ18和BZ-SZ-XJ27进行了菌种鉴定。结果表明：BZ-SZ-XJ18和BZ-SZ-XJ27两菌株分别是Bacillus属和Halomonas属内的新种，分别命名为Bacillus urumqiensis（=CGMCC1.12916T=DSM29145T=JCM30195T）和Halomonas urumqiensis（=CGMCC1.12917 T=JCM30202 T）。
　　同时本课题采用同位素标记相对和绝对定量蛋白组学分析技术，对本实验室保存的嗜盐细菌Natranaerobius thermophiles JW/NM-WN-LFT(DSM18059T)进行盐适应机制的探索。基于iTRAQ的蛋白组学分析共检测到1492个蛋白质，其中显著上调蛋白有114个，显著下调蛋白有128个。差异蛋白的等电点分布较为广泛，其中等电点在3-6的蛋白质占了74%，这与高度的负电荷相关，是嗜盐蛋白质在盐环境中行使功能的主要机制。检测到的蛋白质中发现了和甘氨酸甜菜碱合成过程相关的蛋白质，甘氨酸甜菜碱是嗜盐菌中主要的相容性溶质，对维持处在高盐环境中嗜盐菌的渗透压起着重要的作用，这与之前N. thermophiles菌株中相容性溶质的测定结果也是一致的，说明该菌可利用相容性溶质策略适应高盐环境。另外，也检测到了一些和Na+、K+转运相关的蛋白质，这和基因组测序中预测到的和嗜盐机制相关的一些离子泵相一致，这说明N. thermophiles也可同时利用“内盐”策略适应高盐度的生存环境。
　　用微滴式数字PCR技术对109个上调蛋白进行转录水平的验证，通过比较2.5 M和3.7 M Na+两种盐度条件下上调蛋白对应基因的表达倍数，有90%以上的基因上调倍数在1.5倍以上，且约有93%的基因上调较显著，由此表明转录水平的验证结果和蛋白组学得到的结果较为一致，说明结果的准确性。其中基因表达上调倍数在十倍以上的约占37%，表明这些基因对 Natranaerobius thermophiles对高盐环境的适应起着重要的作用。通过转录水平的验证，为对该菌株嗜盐机制的进一步研究奠定了基础。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 极端微生物概述

1.2 嗜盐菌研究背景

1.3 本课题的研究背景

1.4 本课题的研究意义

1.5 本课题的创新点

第二章 嗜盐细菌BZ-SZ-XJ18T和BZ-SZ-XJ127T的分离与鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 本章小结

第三章 基于iTRAQ技术的N.thermophiles的盐度相关的蛋白组学分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 本章小结

第四章 ddPCR在转录水平验证iTRAQ获得的上调蛋白

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历