有机铁源的化学特性、对肉仔鸡的相对生物学利用率及其小肠铁吸收研究

摘要

本论文共通过五个系列试验，分析了有机铁源的化学特性，研究了不同络（螯）合强度[complex(chelation) strength，quotient of formation(Qf) values，Qf值]有机铁对肉仔鸡的相对生物学利用率，以及其无机铁及不同络（螯）合强度有机铁在肉仔鸡小肠各段的吸收规律和机制。
　　试验一有机铁源的化学特性研究
　　利用等离子体发射光谱法、滴定法、高效液相色谱法和极谱法分析了24种有机铁源（包括6种蛋氨酸铁(Fe-Mets1-6)、10种甘氨酸铁（Fe-Glys1-10）、1种赖氨酸铁（Fe-Lys）、4种蛋白铁（Fe-Prots1-4）、3种复合氨基酸铁（Fe-AAs1-3）以及试剂级硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）的总铁含量、三价铁离子（Fe3+）含量、氨基酸组成、在pH2.0、0.2 M HCl-KCl与pH5.0、0.1 M KH2PO4-K2HPO4的缓冲溶液及去离子水中的溶解度以及各有机铁源的Qf值。
　　结果表明：
　　1）24种有机铁源产品的总铁含量在10.2～20.1％之间，同时含有不同程度的Fe3+（0～5.66%）；
　　2）所测24种有机铁源产品的总氨基酸与铁的摩尔比为0.80：1～2.48：1，其中6种（Fe-Met2、Fe-Gly1、Fe-Gly10、Fe-Prot1、Fe-Prot4和Fe-AA3）有机铁源的摩尔比小于1:1（氨基酸：铁），1种有机铁源（Fe-Prot2）的摩尔比大于2:1（氨基酸：铁），其它12种有机铁源的摩尔比介于1：1～1：2之间；
　　3）有机铁源在不同的溶剂中溶解度差异很大，介于0～100%之间，其中在pH2.0、0.2 M HCl-KCl中的溶解度>在去离子水中的溶解度>在pH5.0、0.1 M的KH2PO4-K2HPO4中的溶解度；
　　4）有19种有机铁源产品（Fe-Mets1-6、Fe-Glys1-10、Fe-Lys、Fe-Prot4和Fe-AA2）的Qf值低于10，属于弱络（螯）合强度有机铁源，有4种有机铁源产品（Fe-Prot1、Fe-Prot3、Fe-AA1和Fe-AA3）的Qf值介于10～100之间，属于中等络（螯）合强度有机铁源，1种有机铁源（Fe-Prot2）的Qf值为8,590，超过1000，属于极强螯合强度有机铁源。以上研究结果表明，有机铁源间的化学特性变异很大，为评价不同有机铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率与其Qf值之间的关系奠定了基础。
　　试验二肉仔鸡对不同络（螯）合强度有机铁源的相对生物学利用率研究
　　1）由于有机铁源的络（螯）合强度是决定其相对生物学利用率的最重要的化学特性，故综合考虑上述24种有机铁源化学特性，从中选出分别属于不同络（螯）合强度类别的3种有机铁源，即弱络合强度有机铁（Fe-Met2，标记为Fe-Met W，14.7%Fe，Qf=1.37）、中等络合强度有机铁（Fe-Prot1，标记为Fe-Prot M，14.2%Fe，Qf=43.6）和极强螯合强度有机铁（Fe-Prot2，标记为Fe-Prot ES，10.2%Fe，Qf=8,590）。选用1,170只1日龄商品代爱拔益加（Arbor Acres，AA）肉公雏进行动物试验，通过观测在玉米-豆粕常用饲粮下，添加不同铁源及铁水平对肉仔鸡生长性能、血液指标、组织铁含量、组织过氧化氢酶（Catalase，CAT）和琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）活性及其基因表达的影响，以评价肉仔鸡对不同络（螯）合强度有机铁源的相对生物学利用率。试验鸡按4╳3+1两因子安排的完全随机设计按体重随机分为13个处理组（每组6个重复，每个重复15只鸡），分别饲喂不添加铁的玉米一豆粕型基础饲粮（为对照组，含铁实测为55.8 mg/kg）和在对照组基础饲粮中以无机硫酸亚铁及以上3种弱、中和极强络（螯）合强度的有机铁源的形式分别添加铁20、40和60 mg/kg。试验期为21天，分别于7、14和21日龄采样分析。结果表明：1）随饲粮中铁水平的增加，14日龄鸡血浆铁饱和度、7日龄和14日龄鸡胫骨铁含量、7日龄、14日龄和21日龄鸡肝脏铁含量、14日龄鸡肾脏铁含量、21日龄鸡肝脏以及7和21日龄鸡肾脏SDH酶活、14日龄鸡肝脏和心脏CAT mRNA水平、21日龄鸡肝脏和肾脏SDH mRNA水平均显著线性增加（P <0.05）；
　　2）以肉仔鸡的实际铁采食量对上述指标作多元线性回归分析，以斜率比法计算各铁源的相对生物学利用率时发现，仅以21日龄鸡肝脏和肾脏SDH mRNA为评价指标时，各铁源之间差异显著（P<0.05）；
　　3）以21日龄鸡肝脏SDH mRNA为评价指标时，弱、中等和极强络（螯）合强度有机铁相对于无机硫酸亚铁（100%）的生物学利用率分别为129%（P=0.18）、164%（P<0.003）和174%（P<0.001）；以21日龄鸡肾脏SDH mRNA水平作为评价指标时，以上三种有机铁源的相对生物学利用率分别为102%（P=0.95）、143%（P=0.09）和174%（P<0.004）。其中，极强螯合强度有机铁源的生物学利用率显著高于弱络合强度有机铁源与无机硫酸亚铁（P<0.05），中等络合强度有机铁与极强螯合强度有机铁之间以及弱络合强度有机铁与无机硫酸亚铁之间的生物学利用率差异不显著（P>0.05）。
　　本次试验研究结果提示，21日龄肉仔鸡肝脏和肾脏SDH mRNA水平为评价肉仔鸡对不同铁源生物学利用率的特异敏感功能性指标；并以其为评价指标综合评价获得Fe-Met W、Fe-Prot M和Fe-Prot ES相对于无机硫酸亚铁（100%）的生物学利用率分别为116、154和174%；采用实用饲粮并在肉仔鸡铁需要量上下添加不同水平铁，采用多元线性斜率比法，以特异敏感功能指标评价获得的不同铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率结果更科学更具实用性。
　　试验三用原位结扎灌注肠段法研究无机硫酸亚铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律及其分子机制
　　本试验包括2个小试验，用原位结扎灌注肠段法研究无机硫酸亚铁在肉仔鸡十二指肠、空肠及回肠的吸收动力学模式及其与二价金属离子转运蛋白1（Divalent Metal Transporter1，DMT1）和高铁转运体1（Ferroportin，FPN1）基因表达的相关性。试验1通过研究不同灌注时间点时肉仔鸡小肠各段无机硫酸亚铁吸收率的变化规律，以确定研究肉仔鸡结扎小肠各段铁吸收动力学的适宜灌注时间。选用100只28日龄铁缺乏的商品代肉公鸡，按体重随机分为5个处理组（每个处理组10个重复，每个重复2只鸡），灌注25μg/ml（0.45 mM）的无机铁（硫酸亚铁），共设0、5、15、30和60 min，共5个采样时间点。结果表明，在0～60 min内，无机铁在肉仔鸡结扎十二指肠和空肠的吸收率均呈渐近线变化，而在回肠中呈现二次曲线变化。根据灌注时间变化拟合方程得到十二指肠、空肠和回肠达到最大吸收率的时间分别为60、60和43 min。十二指肠铁吸收率在灌注后30、45和60 min时显著（P<0.006）高于空肠铁吸收率，并在60 min时高于回肠（P<0.03）。在30 min时各肠段铁吸收率均达到了最大吸收率的85.0%以上，故在试验2中采用的适宜灌注时间为30 min。试验2通过结扎肉仔鸡小肠各段并灌注不同铁浓度0（0 mM）、6.25（0.11 mM）、12.5（0.22 mM）、25（0.45 mM）、50（0.89 mM）、100（1.78 mM）、或200（3.56 mM）μg/ml的硫酸亚铁，观测无机铁吸收速率与灌注铁浓度之间的关系，揭示无机铁在肉仔鸡小肠各段的吸收动力学模式，并通过检测小肠各肠段DMT1和FPN1 mRNA表达水平来研究DMT1和FPN1在铁吸收转运中的作用。试验2选用与试验1相同的28日龄缺铁商品代AA肉公鸡70只，按体重随机分为7个处理组（每个处理组10个重复，每个重复1只鸡）。肉仔鸡小肠各段铁吸收动力学模型表明，十二指肠和空肠的铁吸收符合饱和载体转运模式，回肠铁吸收符合非饱和扩散模式。十二指肠DMT1 mRNA表达水平都显著（P<0.0001）高于空肠和回肠，空肠显著高于（P<0.009）回肠。以上结果表明，十二指肠和空肠的铁吸收以饱和载体转运模式为主，回肠铁吸收以非饱和扩散模式为主，铁在十二指肠和空肠中的吸收方式可能与其DMT1和FPN1的表达有关。
　　试验四用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律
　　采用2╳8二因子完全随机设计，共16个处理组。设置2个灌注铁浓度，分别为：200μg/ml（3.58 mM）和400μg/ml（7.16 mM）。灌注8种铁源，分别为：无机硫酸亚铁、无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物、无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物、蛋氨酸铁、甘氨酸铁、弱络合强度蛋氨酸铁（Fe-Met W, Qf=1.37）、中等络合强度的蛋白铁（Fe-Prot M, Qf=43.6）和极强螯合强度的蛋白铁（Fe-Prot ES, Qf=8,590）。选用160只28日龄铁缺乏的商品代AA肉公鸡，按体重随机分为16个处理组（每个处理组10个重复，每个重复1只鸡），分别以上述铁源灌注不同浓度的铁，于灌注后30 min采样。
　　结果表明：
　　1）灌注液铁浓度为400μg/ml时肉鸡小肠中的铁吸收率高于（P<0.0001）灌注液铁浓度为200μg/ml时肉鸡小肠中的铁吸收率，十二指肠中的铁吸收率显著高于（P<0.003）空肠和回肠，空肠和回肠之间铁吸收率无显著差异（P>0.10），进一步证明十二指肠是肉仔鸡小肠铁吸收的主要部位；
　　2）铁源影响肉仔鸡小肠段中的铁吸收率（P<0.0001），无机硫酸铁与蛋氨酸或甘氨酸混合组铁的吸收率与甘氨酸铁组和蛋氨酸铁组近似（P>0.05），有高于硫酸亚铁的趋势（P=0.10和0.02）。中等和极强络（螯）合强度组的铁吸收显著高于（P<0.01）无机硫酸亚铁组。无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物组、无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物组、蛋氨酸铁组、甘氨酸铁组、弱络合强度的蛋氨酸铁组之间铁吸收率差异不显著（P>0.05）。中等络合强度组与极强螯合强度组之间没有差异（P>0.05）。从数值上看，各处理组铁吸收率由高到低为：极强螯合强度的蛋白铁组>中等络合强度的蛋白铁组>蛋氨酸铁组>甘氨酸铁组>无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物组>无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物组>弱络合强度的蛋氨酸铁组>无机硫酸亚铁组。以上结果进一步表明，十二指肠是肉仔鸡小肠铁的主要吸收部位；有机铁的吸收优于无机铁，且与其Qf值密切相关，其中以极强螯合强度有机铁的吸收最好，中等络合强度有机铁次之，弱络合强度有机铁的最差，与无机硫酸亚铁的近似；将蛋氨酸及甘氨酸分别与硫酸亚铁简单地混合，有促进铁吸收的趋势，其吸收率与蛋氨酸铁、甘氨酸铁以及弱络合强度有机铁的相近。
　　试验五用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中吸收差异的机制
　　本试验在前面试验的基础上，采用原位结扎灌注肠段法，进一步深入研究不同形态铁在肉仔鸡结扎十二指肠中的吸收动力学模式，并探讨其在肉仔鸡小肠中吸收差异的机制。本试验采用4×5两因子完全随机设计，取肉仔鸡十二指肠灌注，灌注液中添加的4种铁源分别为：无机硫酸亚铁、弱络合强度的蛋氨酸铁（Fe-Met W,Qf=1.37）、中等络合强度蛋白铁（Fe-Prot M, Qf=43.6）和极强螯合强度蛋白铁（Fe-Prot ES, Qf=8,590）；灌注液中的铁添加水平分别为50（0.89 mM）、100（1.78 mM）、200（3.56 mM）、400（7.12 mM）和800（14.33 mM）μg/ml。同时设置不添加铁的空白对照组，共21个处理。选用210只28日龄铁缺乏的商品代肉公鸡，按体重随机分为21个处理组（每个处理组10个重复，每个重复1只鸡），分别按上述灌注浓度灌注不同形态铁，于灌注后30 min采样。结果表明：1）铁源影响（P<0.0001）肉仔鸡小肠铁吸收速率。中等和极强络（螯）合强度有机铁的吸收速率高于（P<0.05）无机硫酸亚铁，中等络合强度有机铁和极强络螯合强度有机铁有机铁之间，以及弱络合强度有机铁与其他铁源之间差异不显著（P>0.05）；
　　2）对不同形态铁吸收速率随其添加水平的变化趋势进行非线性回归拟合，发现肉仔鸡十二指肠中不同形态铁的吸收均为饱和载体转运过程。另外，中等络合强度有机铁的Jmax值>（P<0.05）极强螯有机铁的Jmax值>（P<0.05）弱络（螯）合强度有机铁及无机铁的Jmax值。各铁源的Km之间差异不显著（P>0.05）；
　　3）与空白对照组相比，灌注液中添加不同形态铁均抑制了肉仔鸡十二指肠中 DMT1 mRNA表达约50%（P<0.0003），但提高其FPN1 mRNA表达水平约2-3倍（P<0.001）。但不同铁源间的DMT1和FPN1 mRNA表达水平之间无显著差异（P>0.14）；
　　4）灌注液中添加铁源对十二指肠DMT1和FPN1蛋白表达水平无显著影响（P>0.20）。本试验结果表明，有机铁源络（螯）合强度越大，铁吸收越多，但在肉仔鸡十二指肠中均以饱和载体转运方式吸收，DMT1和FPN1以外的载体可能参与了不同形态铁的吸收。
　　综上所述，24种有机铁源的络（螯）合强度（Qf值）等化学特性变异很大；21日龄肉仔鸡肝脏和肾脏SDH mRNA表达水平是评价肉仔鸡对不同形态铁源生物学利用率的特异功能性敏感指标；十二指肠是肉仔鸡小肠铁吸收主要部位；肉仔鸡十二指肠和空肠铁吸收以饱和载体转运方式为主，回肠的铁吸收以非饱和扩散方式为主；有机铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率及其小肠铁吸收均与其Qf值密切相关，Qf值越大，其铁吸收越多，铁相对生物学利用率越高；肉仔鸡十二指肠中除DMT1和FPN1以外的转运载体可能参与了不同形态铁的吸收，尚有待进一步研究。以上研究新成果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用适宜络（螯）合强度的新型高效有机铁添加剂，以促进肉鸡健康和高效地生长发育，同时减少铁排出对环境的污染，保护生态平衡，都具有十分重要的理论与现实指导意义。

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英文缩略表

第一章 绪 论

1.1 有机铁生物学利用率研究进展

1.2 影响有机铁生物学利用率的因素

1.3 铁吸收和代谢

1.4 研究铁吸收的方法

1.5 有机微量元素吸收机制的假说

1.6 本研究的立题依据和研究目的

第二章 有机铁源的化学特性（试验一）

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 肉仔鸡对不同络(螯)合强度有机铁源的相对生物学利用率研究（试验二）

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第四章 用原位结扎灌注肠段法研究无机硫酸亚铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律及其分子机制(试验三)

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4小结

第五章 用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律（试验四）

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 小结

第六章 用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中吸收差异的机制（试验五）

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.3 结果与讨论

6.4 小结

第七章 全文结论、创新点及进一步研究的问题

7.1 主要结论

7.2 创新点

7.2 有待于进一步研究的问题

参考文献

致谢

作者简介