转基因玉米中外源基因整合位点分析及籽粒败育的初步研究

摘要

玉米(Zea mays L.)作为我国重要的粮食作物之一，在我国的农业和工业生产中起着重要作用。玉米螟等害虫严重危害玉米生产，每年导致约10％的玉米产量损失。抗虫转基因玉米的广泛应用可以有效防治玉米虫害，降低玉米产量损失，并减少农药使用量。研发有应用价值的转基因玉米事件，需要明确外源基因在受体基因组中的整合位点，而且外源基因的整合不能对玉米生产性状产生不利影响。
　　本研究所用的抗虫转基因玉米IE034由本实验室创制，前期研究表明该转化事件的外源基因有一个拷贝，并且室内和田间均高抗玉米螟。但是，在研究过程中发现此转基因玉米事件出现籽粒败育的现象。本文首先运用TAIL-PCR分离抗虫转基因玉米IE034的侧翼序列，通过构建Fosmid基因组文库和遗传定位的方法对外源基因的整合位点进行了研究，并对该转基因玉米出现的籽粒败育表型进行了分析。主要研究结果如下:
　　1、通过TAIL-PCR分离出IE034中外源基因插入位置上游旁侧序列，发现外源基因插入到了玉米基因组的重复序列区，并且外源基因在插入玉米基因组中的过程中进行了复杂的整合，部分骨架载体整合到玉米基因组中。
　　2、提取转基因玉米的基因组DNA，构建Fosmid文库并筛选到一个单克隆。测序后发现该单克隆只含有外源基因的5'端侧翼序列，并且侧翼序列为29kb的玉米重复序列。抗虫转基因玉米IE034与自交系B73构建F2代分离群体，转基因植株与非转基因植株出现3∶1分离比，说明外源基因只有一个插入位点。通过BSR-Seq的方法对外源基因进行定位，发现在玉米1号染色体和5号染色体的短臂上均有明显的峰值。通过分子标记验证外源基因插入到5号染色体上，进一步开发标记将外源基因的插入位点缩小在约260 kb的区间内。将构建Fosmid文库得到的29 kb的玉米重复序列与这个区间内的重复序列比对后发现只有一部分能够比对上。
　　3、在田间种植过程中，IE034的产量相对较低，分析发现主要是因为果穗上的部分籽粒败育导致单穗重下降，从而影响产量。为了进一步解析转基因玉米IE034籽粒败育的机理，我们对玉米果穗上正常及败育籽粒进行了转录组分析，发现差异表达的基因有293个。KEGG富集分析显示，差异表达基因主要富集在淀粉和蔗糖代谢、苯丙素生物合成、植物激素信号传导等代谢通路中。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 转基因作物发展概况

1．2 外源基因在基因组中整合位点的研究方法

1．2．1 基于PCR反应的染色体步移技术

1．2．2 基于构建基因组文库的染色体步移技术

1．2．3 图位克隆技术

1．3 玉米籽粒发育研究进展

1．3．1 玉米籽粒发育进程的研究

1．3．2 玉米籽粒形成过程中代谢途径的研究

1．4 本研究目的意义

第二章 外源抗虫基因Cry1Ie在转基因玉米基因组中的整合

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 转基因玉米IE034的5’端侧翼序列分析

2．2．2 转基因玉米IE034的3’端侧翼序列分析

2．3 讨论

第三章 转基因玉米IE034的外源基因定位

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 Fosmid文库构建与筛选结果

3．2．2 Bar基因插入位点定位结果

3．3 讨论

3．3．1 Fosmid文库筛选结果分析

3．3．2 Bar基因插入位点定位策略讨论

第四章 转基因玉米IE034果穗表型观察与籽粒的转录组分析

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 转基因玉米IE034果穗表型的观察

4．2．2 转录组数据与玉米参考基因组序列比对

4．2．3 差异表达基因GO富集分析

4．2．4 差异表达基因KEGG富集分析

4．3 讨论

第五章 全文结论

3．转基因玉米IE034果穗表型观察与籽粒的转录组分析

参考文献

附录

致谢

作者简历