水稻转录因子APIP5调控程序性细胞死亡和免疫机制研究

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。由稻瘟菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是水稻生长过程中最严重的真菌性病害，全球范围内每年因稻瘟病造成的产量损失达水稻总产量的10％-30％。如何有效抑制稻瘟菌的致病性和增强水稻自身的抗病性是当前稻瘟病与水稻互作研究的主要焦点。本论文以课题组前期克隆的水稻广谱抗稻瘟病基因Piz-t以及其相应稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t为基础，通过研究AvrPiz-t在水稻中转录因子类型靶标蛋白APIP5的功能和作用机制，揭示了稻瘟菌如何引起水稻细胞坏死以及水稻如何抑制稻瘟菌从活体营养阶段转换到死体营养阶段的分子机制。
　　酵母双杂交、GST Pull-down和免疫共沉淀等实验证明AvrPiz-t与水稻bZIP类型的转录因子APIP5存在特异性相互作用，而且APIP5的N末端序列是互作的必需区段。酵母共转化等实验表明APIP5能够形成同源二聚体。酵母细胞转录自激活实验表明APIP5全长蛋白和N末端具有较强的自激活活性，植物原生质体转录因子活性实验进一步证明AvrPiz-t可以特异性的抑制APIP5N末端的转录活性。APIP5氨基酸序列包含有功能的NLS和NES基序，APIP5主要定位在植物细胞质和细胞膜中，且与AvrPiz-t共定位在细胞质中。
　　水稻中抑制APIP5的表达能显著诱导细胞死亡。与野生型水稻相比，APIP5 RNAi株系增强了对稻瘟菌的抗耐性和PAMPs诱导的ROS产生。qPCR分析显示，细胞死亡负调控因子在APIP5RNAi株系中下调表达，而植物防御相关基因显著上调表达，说明APIP5是细胞死亡和水稻抗病性的负调控因子。遗传杂交实验表明，水稻中异源表达AvrPiz-t进一步加剧了APIP5 RNAi株系的细胞死亡表型，杂交材料积累了更高水平的H2O2。与APIP5 RNAi相比，APIP5 RNAi*AvrPiz-t株系中APIP5的转录和蛋白水平、以及细胞死亡负调控因子的转录水平进一步降低，表明AvrPiz-t能够促进APIP5介导的细胞死亡过程。然而，当水稻植株表达抗病基因Piz-t时减弱了APIP5介导的细胞死亡表型，杂交材料H2O2的积累也下降了。与APIP5 RNAi相比，APIP5 RNAi*Ptz-t-HA株系中APIP5的转录和蛋白水平、以及细胞死亡负调控因子的转录水平都有所增加。此外，APIP5RNAi*Piz-t-HA水稻中Piz-t蛋白的积累明显减少，表明APIP5是Piz-t累积的正调控因子。GSTpull-down和萤火虫荧光素酶互补实验进一步证明APIP5的N末端与Piz-t蛋白的NT基序相互作用，说明APIP5同时是稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t和水稻抗病蛋白Piz-t的互作因子。我们还发现用携带AvrPiz-t的稻瘟菌株接种不含Piz-t的水稻时，AvrPiz-t能够促进水稻APIP5蛋白的降解，引起细胞坏死，促进稻瘟菌进入死体营养阶段;而在AvrPiz-t与Piz-t介导的抗病反应中，Piz-t和APIP5的蛋白水平都逐渐增加，表明Piz-t能够稳定APIP5蛋白积累以阻止细胞坏死的发生，从而抑制稻瘟菌从活体营养阶段过渡到死体营养阶段。与此同时，APIP5正调控Piz-t蛋白的累积，诱导AvrPiz-t引发的免疫反应。以上结果揭示了寄主R蛋白通过稳定病原菌效应蛋白在寄主中的靶标蛋白，从而抑制效应蛋白激发的细胞坏死的新机制。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物免疫系统

1．1．1 植物PTI反应

1．1．2 植物ETI反应

1．1．3 植物ETS反应

1．2 程序性细胞死亡

1．2．1 动物的程序性细胞死亡

1．2．2 植物的程序性细胞死亡

1．3 植物转录因子在抗病反应中的作用

1．3．1 植物免疫反应中转录因子的调控

1．3．2 转录因子的穿梭

1．3．3 植物转录因子调控NLR蛋白的激活

1．3．4 病原菌效应蛋白对植物转录因子的抑制

1．4 稻瘟菌效应蛋白激发的植物免疫反应

1．4．1 稻瘟菌侵染水稻的机制

1．4．2 稻瘟菌效应蛋白的研究现状

1．4．3 水稻稻瘟病抗性基因的研究现状

1．4．4 病原菌效应蛋白和水稻抗性蛋白的识别机制

1．4．5 稻瘟菌效应蛋白对水稻免疫系统的抑制作用

1．5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 基因号(Accession number)

2．1．4 Western blot实验所用抗体及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 载体构建

2．2．2 质粒DNA的提取和感受态细胞的制备

2．2．3 CTAB法提取水稻总DNA

2．2．4 水稻叶片总RNA的提取和cDNA第一条链的合成

2．2．5 水稻／烟草叶片总蛋白的提取

2．2．6 酵母双杂交实验

2．2．7 GST Pull-down实验

2．2．8 烟草叶片中瞬时表达蛋白

2．2．9 免疫共沉淀

2．2．10 Punch inoculation方法接种稻瘟菌于水稻材料

2．2．11 Spray inoculation方法接种稻瘟菌于水稻材料

2．2．12 ROS实验

2．2．13 DAB染色

2．2．14 水稻遗传杂交

2．2．15 水稻原生质体制备及转化

2．2．16 拟南芥原生质体转录因子活性分析实验

第三章 结果

3．1．2 GST Pull-down实验验证AvrPiz-t与APIP5相互作用

3．1．3 免疫共沉淀实验验证AvrPiz-t与APIP5相互作用

3．1．5 酵母双杂交和LCI验证APIP5的N末端与AvrPiz-t互作

3．1．6 BiFC实验验证APIP5与AvrPiz-t在植物细胞质中相互作用

3．1．7 APIP5形成同源二聚体，二聚化的APIP5与AvrPiz-t相互作用

3．2 APIP5的亚细胞定位以及与AvrPiz-t的共定位

3．2．1 bZIP转录因子APIP5主要定位于植物细胞质和细胞膜

3．2．2 APIP5区段蛋白的亚细胞定位分析

3．2．3 APIP5蛋白的NLS和NES基序是有功能的

3．2．4 APIP5与AvrPiz-t主要共定位于细胞质

3．3 水稻中抑制表达APIP5诱导细胞死亡、ROS产生和对稻瘟菌的抗性

3．3．1 RNAi抑制表达APIP5诱导水稻叶片细胞死亡

3．3．2 抑制表达APIP5引起细胞死亡和抗病相关基因表达变化

3．3．3 抑制表达APIP5促进PAMPs诱导的ROS增加

3．3．4 抑制表达APIP5增强了水稻对稻瘟菌的抗病性

3．3．5 水稻中异源表达AvrPiz-t抑制PAMPs对APIP5的诱导表达

3．3．6 水稻中异源表达AvrPiz-t加剧了APIP5 RNAi诱导的细胞死亡表型

3．4 AvrPiz-t对APIP5转录活性影响分析

3．4．1 APIP5在酵母中具有转录活性

3．4．2 APIP5在植物原生质体中具有转录激活活性

3．4．3 AvrPiz-t特异性的抑制了APIP5的转录激活活性

3．5 Piz-t与APIP5的调控关系分析

3．6 APIP5与R蛋白Piz-t存在相互作用

3．7 APIP5在Piz-t介导的ETI反应后期显著诱导

第四章 讨论与结论

4．1 讨论

4．1．3 APIP5负调控植物细胞死亡

4．1．5 稻瘟菌侵染水稻过程中AvrPiz-t、APIP5和Piz-t的互作模型

4．2 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历