防治西花蓟马的球孢白僵菌液固双相发酵条件优化

摘要

西花蓟马Frankliniella occidentalis( Pergande)是一种世界性分布的危险害虫，2003年在我国北京发现后，迅速扩散并局部暴发成灾，对我国的农作物生产造成极大的危害，成为我国一种重要外来入侵害虫。西花蓟马不仅可以直接取食植物汁液导致植物萎蔫减产，还可以传播多种病毒病，造成更严重损失。目前，随着人们对农药残留、食品及环境安全的关注及西花蓟马抗药性的产生，生物防治在西花蓟马防治中的地位越来越重要。球孢白僵菌Beauveria bassiana作为一种安全无污染的虫生真菌，对西花蓟马具有良好的防治效果，已被开发成多种剂型用于西花蓟马的田间防治。本研究主要以球孢白僵菌菌株XJWLMQ-32为供试菌株，对球孢白僵菌液固双相发酵条件进行了优化。首先，利用4种方法对已退化的菌株进行复壮试验，通过比较菌株的产孢量和毒力，筛选出一种最有效的复壮方法，然后对菌株的液体摇瓶发酵和固体发酵条件进行了优化，确定液固双相发酵的最佳生产工艺，最后利用7L发酵罐对菌株进行放大培养，通过优化发酵罐的条件参数，提高发酵液的质量，进而促进菌株固体产孢，为菌株的规模化生产提供理论和实践依据。试验结果如下：
　　室内筛选的对西花蓟马具有高效致病力的球孢白僵菌菌株XJWLMQ-32，在固体产孢培养基上继代培养8代后菌株退化十分严重。采用4种不同的方法对第8代退化菌株进行复壮试验。结果显示，连续复壮5代后，利用西花蓟马虫体粉培养基复壮的菌株产孢能力和毒力恢复效果最好，产孢量为9.11×108个/cm2，LT50为2.87 d，西花蓟马第5天的累积校正死亡率高于90％；利用胶体几丁质培养基复壮后，菌株的LT50为3.12 d，每代菌株毒力的提升率适中且稳定；蚕蛹粉复壮后，菌株产孢量最高，但毒力的提升率最低且波动较大；利用蝉蜕培养基复壮，菌株产孢和毒力的恢复效果较差。在产孢培养基中同时添加西花蓟马虫体粉和胶体几丁质，其毒力和产孢能力的恢复效果好且稳定，毒力恢复比例由13.39%降为11.45%，产孢量提高比例由40.93%降低为34.66%，仅下降6.27%。综合考虑，在产孢培养基中同时添加适量的虫体粉和胶体几丁质对退化菌株的产孢和毒力恢复效果好且稳定。
　　采用Plackett-Burman试验设计和响应曲面法对菌株液体摇瓶发酵条件进行优化，结果表明，培养温度、装样量、转速和浓度是影响发酵生物量的主要因素，一定范围内的pH变化对此菌株的液体发酵影响较小。在自然pH下，当培养温度27.08℃、装样49.72 mL（250 mL三角瓶）、摇床转速205.45 r/min、接种浓度1.122×107孢子/mL时，发酵48h产生的生物量最大。在优化发酵条件下进行液固双相发酵试验，得到的球孢白僵菌液体发酵生物量为14.769g/L，与模型预测生物量相符，固体发酵后产孢量为20.16g/kg，含孢量1.84×1011孢子/g。
　　以菌株的产孢数为指标，采用单因素试验和正交试验的方法对菌株固体发酵基质进行筛选，并对其固体培养条件进行优化。结果显示，使用麦麸和稻壳作为固体发酵基质，在基质中添加0.3%KH2PO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.1%NH4NO3混匀，保持麦稻比为4:1，料水比为3:1，发酵液接种量为30%，使用15cm×30cm的保鲜袋装料，置于26℃培养箱前3 d黑暗封闭培养，后5d光照开袋培养（光照强度为2500lx）。通过此培养方法得到菌株的产孢数高达(18.30±1.58)×109个/g，显著高于优化前菌株的产孢数。
　　以发酵液中菌株的生物量为指标，优化7L发酵罐发酵参数，对菌株XJWLMQ-32进行放大培养。结果显示，菌株经摇瓶一级发酵后，接种到7L发酵罐中进行二级发酵，利用 NaOH/HCl调节发酵液pH值为6.5，控制发酵罐转速200r/min，通气量6L/min，发酵时间32h，将发酵液接种到固体基质上进行产孢培养。经比较，菌株的产孢数较摇瓶发酵有所提高，孢子粉的含孢量显著高于摇瓶发酵，达到(2.08±0.18)×1011个/g。

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第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 球孢白僵菌的生物学特性

1.3 球孢白僵菌的生产工艺研究进展

1.4 响应面优化

1.5 论文研究目的和意义

第二章 不同方法复壮高毒力球孢白僵菌效果比较

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 球孢白僵菌菌株液体发酵工艺优化

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 球孢白僵菌固体发酵工艺优化

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 球孢白僵菌7L发酵罐发酵条件初探

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 结 论

参考文献

致谢

作者简历