白介素-6对奶牛卵巢颗粒细胞排卵相关基因表达的调节机制

摘要

排卵是雌性哺乳动物生殖活动的关键环节，是由多因素参与调控的复杂过程。炎性细胞因子在卵泡发育及排卵过程中发挥着重要的调节作用，其表达或活性的改变可导致卵巢周期延长并发生排卵障碍。炎性细胞因子对颗粒细胞排卵相关基因表达的调节是其发挥功能的主要途径，但目前研究多集中于IL-1β和TNF-α。已有的报道表明，IL-6在排卵过程中所发挥的作用较其它细胞因子而言更为复杂，我们推测这与IL-6自身的生物学特性有关，并可能在调节炎症反应相关的排卵过程中起到关键作用。但是，目前对于IL-6在卵巢活动周期，特别是在排卵过程中所发挥的生物学调节作用研究较少。
　　本论文以体外原代培养的奶牛卵巢颗粒细胞为研究对象，采用RT-qPCR、westernblotting、 ELISA、ICC等方法，研究了IL-6对颗粒细胞排卵相关基因EGFR、VEGF、NOS、StAR和TIMPs表达的调节作用及其机制。研究结果显示:(1)EGFR高表达于分离自大卵泡（直径＞8mm）的颗粒细胞。给予外源性促性腺激素刺激后发现，FSH较LH对EGFR mRNA表达的上调作用更为明显。高浓度IL-6(10ng/ml)干预不仅能显著下调颗粒细胞EGFRmRNA和蛋白表达，而且也可明显抑制BTC诱导的ERK1/2蛋白的磷酸化水平。IL-6对EGFR表达的抑制作用主要通过激活ERK1/2与PI3K/AKT信号途径实现，此效应可以被ERK1/2与AKT抑制剂所逆转。本部分研究表明，IL-6对颗粒细胞EGFR的调节作用具有多重性，可以分别在mRNA转录、蛋白翻译及生物学活性等水平抑制EGFR的表达及功能。这一抑制作用经ERK1/2和PI3K/AKT途径介导。(2)高浓度IL-6可以显著上调FSH诱导的颗粒细胞VEGF基因及蛋白表达。此外，也可明显促进VEGF上游调节因子HIF-1α和COX2mRNA的表达。在特异性阻断HIF-1α和COX2后，VEGF基因及蛋白表达水平显著降低。IL-6可以通过活化JAK/STAT3信号途径上调颗粒细胞VEGF的表达，这种上调作用可以被JAK抑制剂所削弱。本部分研究表明，IL-6可以通过提高HIF-1α和COX2的表达来促进颗粒细胞VEGF的合成，这种促进作用与JAK/STAT3信号途径活化有关。(3) IL-6及其受体IL-6Rα高表达于分离自大卵泡的颗粒细胞。高浓度IL-6可明显下调颗粒细胞StAR表达及孕激素合成，而对P450scc和3β-HSD表达的影响不显著。IL-6通过活化ERK1/2信号途径下调StAR表达，使用ERK1/2抑制剂可逆转这种抑制作用。本部分研究表明，IL-6可能通过下调StAR的表达以抑制孕激素合成。ERK1/2信号途径参与IL-6对颗粒细胞StAR表达的调节过程。(4)高浓度IL-6可以显著上调颗粒细胞iNOS表达及NO合成，而对eNOS的表达无明显影响。特异性阻断iNOS后，NO合成水平显著降低。IL-6可以通过活化JAK/STAT3途径上调iNOS表达，使用JAK抑制剂可削弱这种上调作用。本部分研究表明，IL-6可以通过上调iNOS基因与蛋白表达来促进颗粒细胞NO的合成。JAK/STAT3信号转导途径介导这一生物学效应。(5)高浓度隐丹参酮(10μM)可以显著下调IL-6诱导的颗粒细胞TIMP2表达。在隐丹参酮干预后的5、15及30min，IL-6诱导的颗粒细胞ERK1/2和STAT3蛋白磷酸化被显著削弱。此外，隐丹参酮也可以下调STAT3通路上游蛋白JAK2的活化水平。隐丹参酮主要通过抑制JAK/STAT3信号通路活化而下调TIMP2的表达，使用JAK/STAT3抑制剂可逆转这种抑制作用。本部分研究表明，隐丹参酮主要通过抑制IL-6受体信号途径下游蛋白的磷酸化而发挥调节作用。JAK/STAT3信号途径参与隐丹参酮抑制IL-6所诱导的颗粒细胞TIMP2表达过程。这不仅可以在分子水平阐明其在治疗排卵障碍性疾病中的作用机制，而且也进一步验证了IL-6在调节排卵过程中的重要作用。
　　总之，本研究从不同层次及角度揭示了存在于卵泡局部的重要炎性细胞因子——IL-6在调控排卵过程中的部分生物学功能，这不仅有利于深入理解卵巢周期性活动的内在机制，而且还可为临床更好地控制与治疗排卵障碍性疾病提供新的干预途径和理论依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 炎性细胞因子在排卵前卵泡的分布特征

1．1．1 IL-1在排卵前卵泡的分布

1．1．3 IL-6在排卵前卵泡的分布

1．2 炎性细胞因子在排萝日中的生物学作用

1．2．1 排卵相关生物学事件

1．2．2 排卵相关基因

1．2．3 排罗日相关信号转导途径

1．3 炎性细胞因子参与排卵障碍性疾病的发生过程

1．4 IL-6在排卵过程中的调节作用及机制

1．5 论文研究目的和意义

第二章 IL-6对颗粒细胞EGF受体表达的调节作用及机制

2．1 材料与方法

2．1．1 抗体与试剂

2．1．2 卵巢颗粒细胞的原代培养

2．1．3 细胞免疫荧光

2．1．4 总RNA提取及cDNA的制备

2．1．5 实时荧光定量PCR

2．1．6 蛋白免疫印迹

2．1．7 统计分析

2．2 实验结果

2．2．1 FSHR大量表达于原代培养细胞

2．2．2 FSH促进颗粒细胞EGFR表达

2．2．3 IL-6抑制颗粒细胞EGFR基因及蛋白表达

2．2．4 IL-6抑制颗粒细胞EGFR的生物学活性

2．2．5 IL-6促进颗粒细胞ERK1／2、STAT3和AKT蛋白磷酸化

2．2．6 ERK1／2和AKT信号途径参与IL-6对颗粒细胞EGFR表达的调节过程

2．3 讨论

第三章 IL-6对颗粒细胞VEGF表达的调节作用及机制

3．1 材料与方法

3．1．1 抗体与试剂

3．1．2 卵巢颗粒细胞的原代培养

3．1．4 实时荧光定量PCR

3．1．5 蛋白免疫印迹

3．1．6 ELISA

3．1．7 统计分析

3．2 实验结果

3．2．2 IL-6促进VEGF上游调节因子HIF-1α与COX2的基因表达

3．2．3 HIF-1α和COX2参与IL-6对颗粒细胞VEGF表达的调节过程

3．2．4 IL-6促进FSH诱导的颗粒细胞ERK1／2与STAT3蛋白磷酸化

3．2．5 JAK／STAT3信号途径参与IL-6对颗粒细胞VEGF表达的调节过程

3．2．6 垂体促性腺激素促进卵巢颗粒细胞IL-6 mRNA表达

3．3 讨论

第四章 IL-6对颗粒细胞孕激素合成的调节作用及机制

4．1 材料与方法

4．1．1 抗体与试剂

4．1．2 卵巢颗粒细胞的原代培养

4．1．4 实时荧光定量PCR

4．1．5 蛋白免疫印迹

4．1．6 ELISA

4．1．7 统计分析

4．2 实验结果

4．2．2 IL-6抑制颗粒细胞孕激素合成限速酶StAR基因表达

4．2．3 IL-6抑制颗粒细胞孕激素合成限速酶StAR蛋白表达

4．2．4 IL-6促进颗粒细胞ERK1／2、SWAT3与AKT蛋白磷酸化

4．2．5 ERK1／2信号途径参与IL-6对颗粒细胞StAR表达的调节过程

4．2．6 IL-6抑制颗粒细胞孕激素的合成与分泌

4．3 讨论

第五章 IL-6对颗粒细胞iNOS表达及NO合成的调节机制

5．1 材料与方法

5．1．1 抗体与试剂

5．1．2 卵巢颗粒细胞的原代培养

5．1．3 总RNA提取及cDNA的制备

5．1．4 实时荧光定量PCR

5．1．5 蛋白免疫印迹

5．1．6 总NO检测

5．1．7 统计分析

5．2 实验结果

5．2．1 IL-6促进卵巢颗粒细胞iNOS基因表达

5．2．2 IL-6促进颗粒细胞iNOS蛋白表达

5．2．4 IL-6通过上调颗粒细胞iNOS表达以促进NO的合成

5．2．5 IL-6促进颗粒细胞ERK1／2与STAT3蛋白磷酸化

5．2．6 IL-6通过JAK／STAT3信号途径对颗粒细胞NO的合成进行调控

5．3 讨论

第六章 隐丹参酮对IL-6诱导颗粒细胞TIMP2表达的调节作用及机制

6．1 材料与方法

6．1．1 抗体与试剂

6．1．2 卵巢颗粒细胞的原代培养

6．1．3 总RNA提取及eDNA的制备

6．1．4 实时荧光定量PCR

6．1．5 蛋白免疫印迹

6．1．6 细胞免疫荧光

6．1．7 统计分析

6．2 实验结果

6．2．2 CTS抑制IL-6诱导的颗粒细胞ERK1／2和STAT3蛋白磷酸化

6．2．3 CTS抑制IL-6诱导颗粒细胞JAK2磷酸化水平

6．2．4 CTS主要通过JAK／STAT3信号途径调节颡粒细胞TIMP2的表达

6．2．5 CTS可以促进颗粒细胞MMP2与MMP9 mRNA的表达

6．2．6 CTS不影响颗粒细胞IL6Rα基因表达和gp130磷酸化

6．3 讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

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