原始生殖细胞和羊水干细胞培养及生物学特性研究

摘要

本研究成功建立了鸡胚原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的体外培养体系，并对其生物学特性进行鉴定。探讨了鸡胚PGCs减数分裂过程及精子发生相关基因表达量的变化。分离培养8w绵羊的羊水干细胞(Amniotic Fluid Stem Cells，AFSCs)并鉴定其生物学特性，为AFSCs应用于组织工程学及细胞移植治疗提供理论依据。研究发现:
　　1使用在孵化箱中孵化5.5 d的鸡胚进行PGCs的分离。在体视显微镜下小心剥离出鸡胚两侧性腺，剪碎后使用0.125％胰蛋白酶+0.02％ EDTA吹打消化，然后接种在培养皿中使用H-DMEM培养，并添加10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，1 mM丙酮酸钠，1％ GlutaMAX，5 ng/mLSCF，5 ng/mL LIF，10 ng/mL bFGF，10 ng/mL IGF等因子促进PGCs的增殖及抑制分化。培养24 h后，可在显微镜下观察到PGCs克隆团的出现，此时的饲养层为鸡胚性腺基质细胞。48 h后显微镜下观察到PGCs克隆团数量增多，体积变大，呈典型的铺路石样。继代培养时使用鸡胚成纤维细胞(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)饲养层。无论是CEF饲养层还是鸡胚性腺基质细胞都能够PGCs保持稳定的未分化状态。在本研究中PGCs可在体外连续培养2个月，经AKP和PAS染色鉴定为阳性;形态上PGCs较一般细胞大，折光性强;RT-PCR、免疫细胞化学鉴定(immunocytochemistry)和流式细胞分析(Flow Cytometry, FCM)结果显示， PGCs对生殖细胞及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESCs)的特异性标志物呈现阳性反应。
　　2鸡胚PGCs在骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)、激活素A(Activin A)和维甲酸(Retinoic Acid，RA)的作用下可启动减数分裂过程，进而在(Bovine Pituitary Extract，BPE)、(Follicle-stimulating hormone，FSH)和睾酮(Testosterone，T)的促进下诱导生成精子。从qPCR结果可证明这些激素促进了PGCs向精子的分化。
　　3在无菌状态下使用注射器抽取8w绵羊胚胎羊水10 mL，并以1500 rpm的速度离心15 min使细胞富集于离心管底部，最终将细胞接种至12孔板中进行培养，培养基选择DMEM/F12添加10 ng/mL bFGF。羊水中含有多种细胞类型，不同类型的细胞形态也不尽相同。传代时选择长梭形细胞占多数的那一孔进行传代操作。消化条件为0.25％胰蛋白酶+0.02％ EDTA于37.5℃培养箱中消化1 min。在经过数次传代细胞纯度较高时，对AFSCs的生物学特性进行鉴定。RT-PCR及免疫细胞化学检测结果显示AFSCs既表达间充质干细胞表面标记物又表达胚胎干细胞特异性标志物。生长曲线实验结果显示AFSCs的增长呈现典型的S型。核型分析结果显示绵羊AFSCs染色体数目为2n=54，形态正常未发生变异。将AFSCs向成脂、成骨、成软骨三个方向进行诱导，特异性染色结果及RT-PCR检测都说明成功诱导生成了脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。表明AFSCs拥有向三个胚层分化的潜能。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 原始生殖细胞的研究进展

1．1．1 PGCs的概念

1．1．2 PGCs的起源与迁移

1．1．3 PGCs的培养条件

1．1．4 PGCs的生物学特性

1．1．5 影响PGCs生长的细胞因子

1．1．6 PGCs的应用前景

1．2 羊水干细胞的研究进展

1．2．1 AFSCs的概念

1．2．2 羊水中细胞的来源及种类

1．2．3 AFSCs的应用前景

第二章 鸡胚原始生殖细胞分离培养及生物学特性研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 鸡胚PGCs分离培养

2．2．2 鸡胚PGCs生物学特性

2．2．3 体外诱导鸡胚PGCs向精子分化

2．3 讨论

2．3．1 鸡胚PGCs的分离培养

2．3．3 鸡胚PGCs精子发生

第三章 绵羊羊水干细胞分离培养及生物学特性研究

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 绵羊AFSCs分离培养

3．2．2 绵羊AFSCs生物学特性

3．2．3 绵羊AFSCs的诱导分化及鉴定

3．3 讨论

3．3．1 绵羊AFSCs的培养条件

3．3．2 绵羊AFSCs的生物学特性

3．3．3 绵羊AFSCs应用

第四章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历