苜蓿内生菌的分离及生防菌株的筛选与鉴定

摘要

苜蓿（alfalfa）是奶牛等草食动物的重要优质饲草之一，被誉为“牧草之王”。内生菌是在植物组织中定植的微生物（通常是细菌、真菌和放线菌）。它们能够产生许多生物活性次生代谢产物，如生物碱、酚酸、醌、类固醇、皂苷、单宁和萜类化合物，作为抗微生物、抗昆虫和抗癌等性能的潜在候选者，也是微生物农药的重要资源。本文分离筛选苜蓿内生菌并评价其生防潜力，结果如下:
　　1、苜蓿内生菌的分离
　　2015-2016年从河北、内蒙古、宁夏共采集符合采集条件的苜蓿样品108株，采用组织研磨法分离获得409株内生菌。其中，细菌306株，真菌101株，放线菌2株。内生菌有125株菌株从苜蓿叶中获得，101株菌株从苜蓿茎中获得，183株菌株从苜蓿根中获得。
　　2、苜蓿内生菌离体平板拮抗评价
　　通过平板拮抗试验，从2015年分离的362株内生菌中筛选出35株对立枯丝核菌、苜蓿镰刀菌、黄瓜枯萎病菌和疫霉菌中至少一种病原茵有抑菌作用菌株。其中，12株内生茵对4种病原菌有拮抗效果，为细菌3株，真菌8株，放线菌1株。内生细菌NANX36L-1对4种病原菌的抑菌效果最好，均达到了抑茵活性极强，鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。内生真菌PDANM2S-4对4种病原菌的平均抑制率最高，为81.2％，鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。
　　3、苜蓿内生菌活体防病评价
　　通过试管苗检测2015年分离的362株内生菌对黄瓜枯萎病的生防效果，结果有37株叶部相对防效≥60％，其中NA NX51R-5、NA HB1S-3和NA NM1S-1防效最好，达到了84％以上。有21株根部防效达到60％以上，其中NANX90R-8防效最好，达到了84％。对筛选获得37株优异菌株，再次进行黄瓜枯萎病活体评价试验，最终筛选出3株高效的生防潜力细菌菌株NANX51R-5、NANX90R-8和NANM1S-1。
　　4、高效生防潜力菌株对苜蓿根腐病的防治作用
　　对筛选获得的上述3株具有优异生防活性的内生细菌进行了苜蓿苗培养皿试验、苜蓿试管苗试验和盆栽试验，结果表明3种内生菌对苜蓿不致病，且NA NM51R-5和NANM1S-1在适当浓度时对苜蓿有促生作用，对尖孢镰刀菌造成的苜蓿根腐病具有明显的防治作用。其中NANM1S-1盆栽相对防效为57.1％。
　　5、内生菌分子鉴定
　　使用现代分子生物学手段，对离体平板拮抗试验中有抑菌效果菌株进行了分子鉴定。结果表明26株内生细菌分属于6个属，其中芽胞杆菌属(Bacillus spp.)和假单胞菌属(Pseudomonasspp.)属于优势菌种。8株内生真菌分属于3个属，其中哈茨木霉为优势种。对选出的3株高效生防菌的分子鉴定表明，NANM1S-1和NANX51R-5为芽胞杆菌(Bacillus spp.)，NANX90R-8为假单胞菌属（Pseudomonas spp.）。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 苜蓿概述

1．1．1 发展现状

1．1．2 优质苜蓿市场分析与问题

1．2 苜蓿病害

1．2．2 苜蓿根部病害

1．2．3 苜蓿病害防治

1．3 植物内生菌

1．3．1 植物内生菌的概念

1．3．2 植物内生菌的研究进展

1．3．3 苜蓿内生菌的研究进展

1．3．4 内生菌防治植物病害的研究进展

1．4 植物内生菌的防治病害的生物学作用与机制

1．4．1 产生次级代谢产物

1．4．2 促生作用

1．4．3 内生菌与病原菌竞争作用

1．4．4 诱导植物产生抗性

1．5 研究意义

1．6 技术路线

第二章 苜蓿的采集与内生菌的分离

2．1 材料

2．1．2 培养基

2．1．3 试验器材

2．2 实验方法

2．2．1 苜蓿的采集

2．2．3 植株内生菌的分离纯化

2．3 结果与分析

2．3．1 苜蓿采集

2．3．2 表面消毒体系的建立

2．3．3 内生菌分离结果

2．4 本章讨论

第三章 苜蓿内生菌离体抑菌效果评价

3．1 材料

3．1．1 供试病原菌及培养基

3．1．2 试验器材

3．2 方法

3．2．1 内生菌株拮抗活性评价

3．3 结果与分析

3．3．1 内生细菌拮抗效果

3．3．2 内生真菌拮抗效果

3．3．3 内生放线菌拮抗效果

3．4 本章讨论

第四章 苜蓿内生菌活体防病效果评价

4．1 材料

4．1．1 供试病原菌及种子

4．2．1 内生菌活体防病试验评价

4．3 结果

4．3．1 对黄瓜叶部枯萎病防效评价

4．3．2 对黄瓜根部枯萎病防效评价

4．3．3 离体抑菌与活体防病评价方法的比较

4．3．4 优异生防内生菌的筛选

4．4 本章讨论

第五章 优异内生菌对苜蓿根腐病的防治作用评价

5．1 材料

5．1．1 供试菌株

5．1．2 主要培养基及主要试剂

5．2．1 内生菌和病原菌对苜蓿幼苗影响

5．2．2 内生菌对苜蓿根腐病生防效果评价

5．2．3 内生菌对苜蓿根腐病生防效果盆栽试验

5．2．4 数据分析

5．3 结果

5．3．1 苜蓿苗培养皿生防试验结果

5．3．2 苜蓿苗试管生防试验结果

5．3．3 苜蓿盆栽生防试验结果

5．4 本章讨论

第六章 内生菌的分子鉴定

6．1 材料

6．1．1 供试菌株

6．1．2 主要试剂

6．1．3 引物

6．2 试验方法

6．2．1 真菌DNA提取

6．2．2 内生生防菌16S rDNA分子鉴定

6．2．3 内生真菌的分子鉴定

6．3 结果与分析

6．3．1 有离体抑菌活性内生菌DNA提取及系统进化树构建

6．3．2 高效生防潜力菌株DNA提取及分类地位的确定

6．3．3 高效生防潜力菌株的分类地位的确定

6．4 本章讨论

第七章 全文总结

参考文献

致谢

附录

作者简历