湖南、海南省菜豆金色花叶病毒属病毒的鉴定

摘要

双生病毒科病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒，由烟粉虱或叶蝉为媒介进行传播，寄主范围十分广泛，在热带和亚热带地区对多种作物造成毁灭性危害。近年来双生病毒在我国的危害范围不断扩大，云南、重庆、海南、广西、山东等多个省份均已发现其侵染，因此对双生病毒的早期检测也变得越来越重要。为了进一步确定双生病毒在我国的传播、分布和发生规律，本论文对从湖南地区采集到的6例和海南采集到的1例疑似双生病毒侵染的样品进行了检测和分子鉴定。
　　2016年，我们在湖南省发现洋姜、番茄、萝卜、赛葵、甘薯和牵牛花等6种植物表现卷叶、叶片发黄、矮化等疑似双生病毒侵染的症状。随后从采集到的叶片样品中分别提取总DNA，并以其为模板进行了RCA(Rolling cycle amplification，RCA)扩增，基于RCA-PCR技术，在未知病毒序列的情况下，通过酶切RCA产物得到了部分病毒基因组片段。根据测得的部分序列，我们设计特异引物去扩增分离物的DNA-A序列全长。在GenB ank数据库，将得到的全长核苷酸序列分别进行BLAST同源性检索，结果表明，番茄和牵牛花均被双生病毒侵染:番茄样品分离物的DNA-A组份全长为2781 nt，与番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV）的分离物TYLCV-YN4392(KU934104)的同源序列相似性最高，为99％;牵牛花样品分离物的DNA-A组份全长为2827 nt，与甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)的分离物SPLCV-JS(FJ176701)的同源序列相似性最高，为99％。同时我们分别利用DNA-B组份的通用引物CR01/CR02和DNAβ的通用引物beta01/beta02对样品进行PCR扩增，结果均未检测到DNA-B或DNAβ组份，这些结果表明我们检测到的番茄分离物和牵牛花分离物均为双生病毒科中的菜豆金色花叶病毒属的单组份DNA-A病毒，共编码6个ORFs(Open Reading Frames，ORF)，其中病毒链编码2个ORFs:AV1和AV2;互补链编码4个ORFs:AC1、AC2、AC3和AC4。这是在湖南省首次发现并报道双生病毒全核苷酸序列。
　　2016年，我们在海南省发现了表现为皱缩、耳突等疑似双生病毒侵染症状的番茄植株，将样品叶片提取DNA后进行RCA扩增，再利用双生病毒的通用引物BegoAFor01/BegoARev1和beta01/beta02对样品进行PCR扩增，将得到的全长核苷酸序列在NCBI数据库中检索，结果表明，该番茄分离物和中国番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)的同源性最高，为99％。同时检测到了其伴随的卫星DNAβ序列。这是在海南省首次发现并报道TYLCCNV的全核苷酸序列。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 双生病毒的发生与危害

1．2 双生病毒的检测

1．2．3 PCR检测法

1．2．4 滚环扩增

1．2．5 高通量测序

1．3 双生病毒的分类和基本特征

1．4 番茄黄化曲叶病毒的研究概况

1．5 甘薯曲叶病毒的研究概况

1．6 中国番茄黄曲叶病毒的研究概况

1．7 双生病毒的分类原则

第二章 湖南省番茄和牵牛花上的双生病毒分子鉴定

2．1 材料和仪器

2．1．1 材料

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液的配方

2．1．5 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 叶片总DNA提取

2．2．2 病毒基因组的滚环扩增(RCA)

2．2．3 酶切样品RCA产物

2．2．4 DNA片段的纯化

2．2．5 PCR扩增

2．2．6 DNA克隆技术

2．2．7 重组质粒的鉴定

2．2．8 基因组序列测定和分析

2．3 结果与分析

2．3．1 RCA产物酶切检测结果

2．3．2 DNA-A全长序列扩增

2．3．3 TYLCV-HN和SPLCV-HN的基因组结构

2．3．4 TYLCV-HN及SPLCV-HN的序列分析

2．3．5 TYLCV-HN及SPLCV-HN的进化树构建及分析

2．3．6 DNA-B组份检测结果

2．3．7 DNAβ组份检测结果

2．4 讨论

第三章 海南省番茄上的双生病毒的分子鉴定

3．1 材料和仪器

3．1．1 材料

3．1．4 主要溶液的配方

3．1．5 主要仪器

3．2 方法

3．2．4 PCR扩增

3．2．5 DNA克隆技术

3．2．6 重组质粒的鉴定

3．2．7 基因组序列测定和分析

3．3 结果与分析

3．3．3 DNA-A组份的基因组结构

3．3．4 DNA-A组份的BLAST序列分析

3．3．6 DNA-B组份检测结果

3．3．8 DNA-β组份的基因组结构

3．3．10 DNAβ组份的进化树构建及分析

3．4 讨论

第四章 全文结论

附文

参考文献

附录

致谢

作者简历