菰遗传多样性与ZlBBR1基因的功能分析

摘要

菰不仅是水稻育种天然的基因资源库，还有着巨大的生态作用和潜在的经济价值。目前，菰的基础资料，如野生菰种群生长情况、遗传多样性高低、遗传结构现状、演进历程以及菰与水稻在抗性基因分子层面的进化关系等仍不甚清楚或完全空白。更重要的是菰重要有利基因包括抗病性基因的发掘与利用研究也进展缓慢。本研究借助多种统计分析软件利用7对菰自身SSR分子标记对来自华中、华东5大湖区的26个野生菰居群的遗传多样性和遗传结构进行了分析;在原有的工作基础上，利用反向遗传学手段克隆了菰抗病基因ZlBBR1(Zizania latifolia Bacterial BlightResistance1)，并对该基因的功能进行了验证和分析;利用同源克隆手段从来自全国的菰样品材料及水稻常用种质资源材料中鉴定ZlBBR1的同源基因并进行生物信息学分析。主要取得以下结果:
　　1.华中、华东野生菰具有较丰富的遗传多样性(PPB=92.19％、Ao=1.922、Ae=1.454、He=0.274、I=0.422)，各野生菰居群间的遗传相似性系数和遗传距离分别介于0.5569～0.9981和0.0019～0.5854之间，居群间的遗传分化较显著(Gst=0.673)。进化分析显示，26个野生菰居群具有共同的祖先，在进化上分属两支，居群间不存在明显的亲缘地理关系。
　　2.反向遗传学手段克隆了菰ZlBBR1全基因，同源克隆了全国范围内样本中菰ZlBBR1等位基因。该基因非常保守，在氨基酸水平上仅有两个等位基因，ZlBBR1-1、ZlBBR1-2分别编码1080个AA和1078个AA。
　　3.表达模式分析发现菰ZlBBR1基因主要在地上部分表达，该基因编码一个CC-NBS-LRR类型抗病(R)蛋白，烟草下表皮细胞瞬时表达发现其定位于细胞膜上。
　　4.菰ZlBBR1基因自身启动子驱动自身基因的表达载体转化日本晴，无论是当代还是高世代纯系材料对白叶枯病小种PXO71的抗性都极显著增强，而过表达植株不表现对PXO71抗性的增强。三个转基因纯系材料水杨酸(SA)的含量在接种处理后的48h对照材料相比都存在极显著升高，而JA含量与此相反。纵向水平上，L1株系接种72h和0h相比有病程相关基因和植物激素信号转导相关基因的富集;在横向水平上，L1株系接种72h后和对照材料接种72h后相比，有超氧化物代谢相关基因的显著富集。涉及病程相关基因12个，植物激素信号转导相关基因9个，其中7个基因同属TIFY基因家族。
　　5.OsBBR1基因各个结构域均存在变异，其中NB-ARC结构域内变异最多，而coiled-coil结构域内变异最少。OsBBR1基因水稻粳稻亚种中不遵循中性进化，导致这种瓶颈的原因可能是用来驯化粳稻的野生稻祖先非常有限。
　　这些研究结果，一方面为完善我国菰基础信息资料及该物种的保护、种质利用提供了理论参考，另一方面为水稻抗病育种提供了具有理论研究价值的新材料，再一方面加深了我们对抗性基因进化的认识。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1．1 菰的种类及分布

1．1．2 菰的起源驯化

1．2 菰米的营养价值与功效

1．3 菰与生态环境的关系

1．4 野生菰资源遗传多样性及遗传结构分析

1．4．1 所使用的标记

1．4．2 常用分析软件

1．4．3 中国野生菰的遗传现状

1．5 菰基因组与水稻基因组的比较

1．6 菰与水稻育种

1．6．1 杂交手段的尝试

1．6．2 转基因手段的尝试

1．6．3 菰优异性状控制基因挖掘的实践

1．7 抗病基因与植物免疫

1．7．1 植物抗病基因

1．7．2 植物免疫

1．8 本研究的目的意义

第二章 华中、华东五大湖区野生菰的遗传结构与多样性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 华中、华东野生菰的遗传多样性

2．2．2 中国野生菰的遗传结构分析

2．2．3 聚类和进化关系分析

2．3 小结

2．4 讨论

第三章 菰ZIBBR1基因的克隆及功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 主要实验方法

3．2 结果与分析

3．2．2 菰ZIBBR1基因功能预测

3．2．3 菰ZIBBR1基因编码蛋白的亚细胞定位

3．2．5 转菰ZIBBR1基因水稻材料对PXO71的抗性统计

3．2．6 三个纯系材料对PX071抗性反应中的激素变化

3．2．7 纯系材料L1对PXO71抗性反应中的转录水平变化

3．3 小结

3．4 讨论

第四章 ZIBBR1同源基因的鉴定及生物信息学分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 鄱阳湖区菰ZIBBR1的鉴定和进化分析

4．2．2 全国范围内菰样品ZIBBR1基因编码区差异位点分析

4．2．3 常规水稻材料中OsBBR1同源基因的鉴定及进化分析

4．3 小结

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历