高产类胡萝卜素巴斯德毕赤酵母表达宿主菌的构建

摘要

分泌型的巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前酶工业生产中应用最广泛的高效表达宿主菌之一，其高密度发酵培养产生的大量菌体利用率低，从而造成了大量的资源浪费，因此进一步开发具有高附加值的毕赤酵母菌体具有重要的研究意义和应用价值。类胡萝卜素在人类健康和生活中发挥着重要作用，已广泛应用于食品、饲料、保健品等领域。本研究旨在向毕赤酵母宿主菌株GS115中导入类胡萝卜素合成途径中的关键基因，获得能够在胞内高产类胡萝卜素而胞外高效分泌表达异源蛋白的工程菌，最终实现工业生产中菌体资源的高附加值利用。
　　本研究选择了6个不同的强组成型启动子PGCW14、PTEF、PPGK1、PGAP、PILV5和PAOD，及其相应的终止子用于表达来源于红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的β-胡萝卜素(β-Carotene)和虾青素(Astaxanthin)合成途径中的关键基因（idi、crtE、crt YB、crtI、crtS和crtR）。各基因表达框之间均没有同源序列，有效的提高了重组菌株的遗传稳定性。通过构建pPICZαA-idi-crtE-crtYB-crtI和pPICZαA-idi-crtE-crtYB-crtI-crtS-crt重组载体并转化到GS115菌株中，分别筛选得到一株能够在细胞内高效合成β-胡萝卜素的重组菌GS115-CARO（培养72 h后其β-胡萝卜素产量为28 mg/g细胞干重）和一株产虾青素的菌株。
　　选取来源于嗜热篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)的甘露聚糖酶基因man5T来验证外源基因在宿主菌P.pastoris GS115和P.pastoris GS115-CARO中异源表达的差异。分别将man5T基因转化到GS115和GS115-CARO宿主菌株后，筛选出甘露聚糖酶活性最高的阳性克隆子，其摇瓶水平上的甘露聚糖酶表达量分别为280 U/mL和286 U/mL，没有显著差异(P＞0.05)，但宿主菌GS115-CARO的胞内β-胡萝卜素产量高达到31.27 mg/g细胞干重。结果表明工程菌株GS115-CARO作为表达宿主菌不仅可以实现外源蛋白的高效表达，还能高产胡萝卜素，有效地提升酵母菌体资源的利用价值。
　　本研究构建的高产β-胡萝卜素的巴斯德毕赤酵母工程菌GS115-CARO具有较好的遗传稳定性，表达外源蛋白的能力和常用宿主菌GS115相当，可用作表达宿主菌。在高密度发酵过程中可以同时实现胞内合成胡萝卜素，胞外高效表达外源蛋白，从而有效的提升菌体资源的利用价值，变废为宝，在保护环境和提高经济效益方面都有重要的意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 毕赤酵母表达系统研究进展

1．1．1 毕赤酵母表达系统简介

1．1．2 毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

1．1．3 毕赤酵母表达系统中组成型启动子简介

1．2 类胡萝卜素的研究进展

1．2．2 类胡萝卜素的提取方式

1．3 红发夫酵母的简介

1．3．1 红发夫酵母中类胡萝卜素的合成途径简介

1．3．2 红发夫酵母中类胡萝卜素合成的相关基因简介

1．4 本研究的技术路线

1．5 本研究的目的与意义

第二章 β-胡萝卜素合成途径关键酶基因的克隆、表达

2．1 实验材料

2．1．1 菌种及质粒

2．1．2 引物合成及测序

2．1．3 试剂及试剂盒

2．1．4 培养基及试剂的配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 红发夫酵母培养方法

2．2．2 红发夫酵母cDNA的获得

2．2．3 毕赤酵母GS115基因组DNA的提取

2．2．4 引物设计

2．2．5 来源于Xdendrorhous β-胡萝卜素合成相关基因的克隆

2．2．6 真核表达载体pPICZaA-idi-crtE-crtYB-crtI的构建

2．2．7 β-胡萝卜素相关合成酶在毕赤酵母中的表达

2．2．8 菌体的处理与色素的提取

2．3 实验结果与分析

2．3．1 RNA的提取及cDNA的获取

2．3．3 胡萝卜素合成表达载体pPICZaA-idi-crtE-crtYB-crtI的构建

2．3．4 β-胡萝卜素合成相关酶在毕赤酵母中的表达

2．3．5 菌体的处理与色素的提取

2．3．6 β-胡萝卜素的测定

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 虾青素合成途径关键酶基因的克隆、表达

3．1 实验材料

3．1．1 菌株与载体

3．1．2 试剂、工具酶与试剂盒

3．1．3 培养基

3．1．4 引物序列合成与DNA测序

3．1．5 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 虾青素合成代谢途径中相关酶基因序列的获得

3．2．3 真核表达载体pPICZaA-idi-crtE-crtYB-crtI-crtS-crtR的构建

3．2．4 虾青素合成相关酶在GS115中的表达

3．2．5 菌体的处理与虾青素的提取

3．2．6 虾青素的测定

3．3 实验结果与分析

3．3．1 虾青素相关合成酶编码基因的获得

3．3．2 真核表达载体pPICZαA-idi-crtE-crtYB-crtl-crtS-crtR的构建

3．3．3 虾青素合成相关酶在GS115中的表达

3．3．4 菌体的处理与色素的提取

3．3．5 虾青素的测定结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 甘露聚糖酶Man5T在GS115-CARO中的表达

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与载体

4．1．2 试剂

4．1．3 引物的合成及DNA测序

4．1．4 培养基及试剂的配置

4．1．5 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 真核表达载体pPIC9-man5T的构建

4．2．3 重组甘露聚糖酶Man5T在GS115中的表达

4．3 实验结果

4．3．1 man5TDNA序列的获得

4．3．2 甘露聚糖酶Man5T在GS115和GS115-CARO中的表达

4．3．3 重组工程菌GS115-CARO-M5T甘露聚糖酶活性分析

4．3．4 重组工程菌GS115-CARO-M5T胞内β-胡萝卜素产量分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历