柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建及钙依赖蛋白激酶3相互作用蛋白的筛选

摘要

近年来，由于抗球虫药的大量使用，球虫耐药性的产生给球虫病的防治带来极大的挑战，球虫疫苗的研究以及新的药物靶标的筛选已迫在眉睫。钙依赖蛋白激酶(Calcium dependent proteinkinases，CDPKs)作为多基因编码的大家族中的成员，通过Ca2+信号通路向下游传递磷酸化信号而产生级联放大效应，从而使相关蛋白发挥功能。本实验室前期对EtCDPK3基因特性进行了研究，结果表明EtCDPK3蛋白在球虫子孢子阶段高表达，在虫体入侵和逸出宿主细胞过程中发挥一定的作用。为了筛选EtCDPK3的作用底物，本研究构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，以EtCDPK3为诱饵构建重组质粒pGBKT7-EtCDPK3，对子孢子cDNA文库进行筛选，并对筛选阳性克隆的EST序列进行Blast比对和生物信息学分析，随机挑选三个阳性克隆EST序列，对其进行基因克隆、构建真核重组质粒以及与EtCDPK3相互作用关系的验证。
　　1.柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建
　　提取纯化的柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA，经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后，利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA)，dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后ds cDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共转化到酵母感受态细胞Y187中，dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接，经过缺陷性培养基(SD/-Leu)筛选得到子孢子酵母双杂交cDNA文库。结果显示，构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec，文库滴度为3.62×107 cfu/mL，随机挑取32个单克隆进行PCR检测，插入片段的大小在200 bp～2000 bp之间，重组率为93.75％，并以该文库作为模板，用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增，获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。
　　2.诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建及互作蛋白的筛选
　　根据GeneBank上EtCDPK3的基因序列设计引物，克隆获得了含EtCDPK3ORF的基因片段。用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ对EtCDPK3和pGBKT7空质粒进行双酶切，将回收的双酶切产物连接转化大肠杆菌感受态细胞(TOP10)，经测序及双酶切验证，成功构建了诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK3。将其转化到Y2HGold酵母感受态细胞中，并对该菌株的自转录活性、细胞毒性以及蛋白的表达进行了鉴定，结果表明含有诱饵重组质粒的Y2HGold酵母菌株没有自激活活性，诱饵质粒对酵母细胞不存在细胞毒性，而且诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3可以在酵母细胞中成功表达，因此，构建的诱饵重组质粒可用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。将转化诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3的Y2HGold诱饵菌株与构建的子孢子酵母双杂交cDNA文库进行双杂交，融合好的混悬液均匀涂布在高度缺陷性固体培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上，再将平板上的单克隆转移到含SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba固体培养基进行筛选，重复两次，生长良好的蓝斑克隆即为阳性克隆。阳性克隆经过质粒提取、测序结果分析，去除重复的基因序列，最终筛选到11个阳性质粒。
　　3.EtCDPK3蛋白与阳性克隆蛋白互作的验证
　　随机挑取3个阳性质粒（编号:Et12、Et14、Et27）进行回复杂交验证，发现在高度缺陷性培养基上有蓝色单克隆长出，推测这些阳性质粒与诱饵质粒之间可能存在互作关系。为了进一步验证它们的关系，我们用PCR技术扩增了3个基因的ORF序列，并成功构建了用于BiFC系统的真核重组表达质粒pBiFC-VC155-Et12、pBiFC-VC155-Et14、pBiFC-VC155-Et27，同时将EtCDPK3连接到pBiFC-VN155载体构建了重组质粒pBiFC-VN155-EtCDPK3，将鉴定正确的3个阳性重组质粒分别与pBiFC-VN155-EtCDPK3共转染到DF-1细胞中，倒置荧光显微镜下观察，结果显示除阳性对照有绿色荧光以外，阴性对照和样品组均没有绿色荧光存在;同时又构建了真核重组质粒 pcDNA3.1-flag-Et12、 pcDNA3.1-flag-Et14、 pcDNA3.1-flag-Et27与pcDNA3.1-EtCDPK3，间接免疫荧光和Western blot的结果表明重组质粒在DF-1细胞中能够成功表达。经免疫共沉淀实验验证，结果表明Flag标签单抗可以沉淀Et12、Et14、Et27表达的蛋白，但是不能沉淀EtCDPK3表达的蛋白。上述实验结果表明，Et12、Et14、Et27与EtCDPK3可能不存在相互作用关系。
　　4.EtCHP12功能特性的初步研究
　　生物信息学分析发现，EtCHP12基因的ORF为1656 bp，编码551个氨基酸，为柔嫩艾美耳球虫保守未知蛋白，为了进一步验证EtCHP12的功能，PCR扩增了EtCHP12基因的ORF全长，连接到原核表达载体pET-28a成功构建了原核重组表达质粒pET-28a-EtCHP12，并在大肠杆菌BL21中成功表达，获得可溶性的重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清。体外抑制实验结果表明，纯化后的抗rEtCHP12多抗作用子孢子后，与正常兔血清IgG组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降，且随着抗体浓度的不断增大，子孢子入侵力逐渐降低，抑制率逐渐上升，当抗体浓度为100μg/mL，抑制率高达60％。说明EtCHP12蛋白在子孢子入侵过程中发挥了重要的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 酵母双杂交技术

1．1．1 酵母双杂交技术的原理

1．1．2 酵母双杂交技术的优势

1．1．3 酵母双杂交技术的局限性

1．1．4 酵母双杂交在顶复器原虫研究中的应用

1．2 噬菌体展示技术

1．2．1 噬菌体展示技术的原理

1．2．2 噬菌体展示技术的优势及特点

1．2．3 噬菌体展示技术的局限

1．2．4 噬菌体展示技术在蛋白互作中的应用

1．3 免疫共沉淀技术

1．3．1 免疫共沉淀原理

1．3．2 免疫共沉淀的优势

1．3．3 免疫共沉淀的局限性

1．3．4 免疫共沉淀的应用

1．4 双分子荧光互补技术

1．4．1 双分子荧光互补的原理

1．4．2 双分子荧光互补的优势以及局限性

1．4．3 双分子荧光互补技术的应用

1．5 展望

第二章 柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验虫株

2．2．3 实验试剂

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 引物设计

2．2．6 柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集与纯化

2．2．7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的提取

2．2．8 第一链的合成

2．2．9 双链的合成及纯化

2．2．10 酵母感受态的制备及文库的构建

2．2．11 文库质量的鉴定

2．2．12 用柔嫩艾美耳球虫特异性引物从文库中钓取基因

2．3 结果

2．3．1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊及子孢子的纯化

2．3．2 子孢子总RNA的提取

2．3．3 双链cDNA的扩增及纯化

2．3．4 文库质量的鉴定

2．3．5 特异性引物扩增获得球虫基因

2．4 讨论

第三章 诱饵载体pGBKT7-EtCDPK3的构建以及互作蛋白的筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌株

3．2．2 试剂

3．2．3 主要试剂的配置

3．2．4 诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建

3．2．5 诱饵菌株的制备与鉴定

3．2．6 重组质粒pGBKT7-EtCDPK3互作蛋白的筛选

3．2．7 阳性克隆插入片段的鉴定

3．2．8 阳性克隆质粒的提取与纯化

3．3 结果

3．3．1 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建

3．3．2 诱饵菌株的构建

3．3．4 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3对酵母细胞毒性的检测

3．3．5 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3蛋白在酵母菌中表达检测

3．3．6 互作蛋白的初步筛选

3．3．7 PCR扩增阳性克隆中cDNA插入片段

3．3．8 插入片段质粒的提取与鉴定

3．4 讨论

第四章 诱饵蛋白EtCDPK3与阳性克隆蛋白互作的验证

4．1 引言

4．2．1 主要试剂

4．2 材料与方法

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 回复杂交

4．2．4 Et12、Et14、Et27基因的克隆

4．2．5 双分子荧光互补实验(BiFC)

4．2．6 间接免疫荧光鉴定真核质粒在DF-1中的表达情况

4．3 结果

4．3．1 回复杂交验证

4．3．2 BiFC真核重组质粒的构建

4．3．3 BiFC检测蛋白的互作

4．3．4 Co-IP实验真核重组质粒的构建

4．3．5 间接免疫荧光鉴定重组质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．3．6 Western blot鉴定重组质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．3．7 免疫共沉淀结果

4．4 讨论

第五章 柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP12功能初步分析

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验动物

5．2．2 所用载体及细胞

5．2．3 主要实验试剂

5．2．4 EtCHP12基因的克隆和序列分析

5．2．7 重组蛋白His-EtCHP12亲和层析纯化

5．2．8 重组蛋白多克隆抗体的制备与纯化

5．2．10 抗rEtCHP12多克隆抗体体外抑制分析

5．3 结果

5．3．2 蛋白EtCHP12基因序列生物信息学分析

5．3．3 重组质粒pET-28a-EtCHP12的构建与鉴定

5．3．4 原核重组蛋白的表达及存在形式

5．3．5 原核重组蛋白的纯化

5．3．6 多克隆抗体的制备与纯化

5．3．7 重组蛋白免疫原性和反应原性分析

5．3．8 体外抑制实验结果

5．4 讨论

第六章 全文总结

参考文献

致谢

作者简历