苹果斑点落叶病抗病基因Mald1的克隆及功能分析

摘要

苹果斑点落叶病作为严重的真菌病害，每年会对我国苹果产业经济造成重要影响。目前，国内外针对该病的研究主要集中于防治方法、病原菌鉴定、抗病品种的选育等，但对其抗病机理并不明确。近来有研究发现，苹果叶片受斑点落叶病、黑星病、火疫病胁迫后，可诱导Mald1基因表达参与防御反应，但其在苹果防御反应过程中的具体作用还需进一步挖掘。鉴于苹果抗病基因挖掘的重要意义，本研究克隆了抗病相关Mald1基因，初步完成了其功能鉴定，解析了Mald1基因在苹果抗病过程中的表达特点，研究结果将为进一步开展苹果抗病新种质的遗传改良和定向选育提供理论依据和技术参考。
　　本文以‘王林’苹果叶片为试材，克隆得到Mald1基因，通过生物信息学分析、表达特性分析、转基因植物材料抗病性鉴定、融合蛋白的诱导表达等方法对该基因的功能进行了初步研究，获得的主要研究结果如下:
　　1.通过生物信息学分析发现Mald1开放阅读框长度为480 bp，编码159个氨基酸残基，包含2个外显子和1个内含子，预测由19种已知氨基酸组成，分子量约为17.62kD，等电点为5.68，脂肪族指数为82.26，不稳定指数为31.80，预测为亲水性蛋白。利用PSORT Prediction工具对苹果Mal d1蛋白进行细胞定位，推测苹果Mal d1蛋白极有可能存在于细胞质当中。根据Mal d1蛋白的三维结构预测模型可知:可能构成α螺旋结构的推测有35个氨基酸、构成β折叠结构的推测有48个氨基酸、构成无规则卷曲的推测有76个氨基酸。
　　2.实时荧光定量PCR分析结果显示，Mal d1在苹果叶、花、果皮、果肉中均有表达，但各器官中表达水平存在差异;在不同发育时期的果皮中都有表达，表达量随时间的延长呈先上升后下降的趋势;在不同品种叶片中均有表达，特别是抗性品种叶片中表达水平较高;在叶片人工接种病菌条件下表达量随时间的延长明显高于对照组。上述结果表明Mal d1基因参与植物与病原菌的互作。
　　3.利用PRI101-AN载体和农杆菌介导的遗传转化方法转化苹果愈伤组织并进行转基因愈伤组织抗病鉴定，结果显示转Mald1基因的愈伤组织相较未转基因的愈伤组织，发病晚、症状轻、病菌发展速度慢。
　　4.将Mald1基因与原核表达载体pColdⅡ连接，经测序确定所构建的重组载体pCold-Mal d1开放阅读框正确。将获得的重组质粒pCold-Mal d1转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经冷诱导后SDS-PAGE电泳检测，证明Mald1蛋白获得了稳定而高效的表达，所表达蛋白是大小约为22.4 kD的融合蛋白，后经镍柱纯化后获得相对单一的蛋白，可用于免疫组织化学，蛋白印记检测等。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 概述

1．2 苹果斑点落叶病

1．2．1 发病特点

1．2．2 致病机理

1．2．3 侵染条件

1．2．4 苹果斑点落叶病的抗性研究

1．3 Mal d 1基因的研究进展

1．4 果树抗病相关研究进展

1．4．1 果树抗病反应

1．4．2 果树抗病基因

1．5 苹果转基因技术的研究进展

1．6 研究目的和意义

第二章 抗苹果斑点落叶病基因Mal d 1的克隆及表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 生物信息学分析

2．1．3 叶片侵染

2．1．4 RNA的提取及cDNA第一链的合成

2．1．5 基因克隆

2．1．6 表达分析

2．1．7 过表达载体的构建

2．1．8 转基因愈伤组织的获得和抗病性鉴定

2．2 结果与分析

2．2．1 苹果Mal d 1基因克隆与序列分析

2．2．2 Mal d 1蛋白系统进化树分析

2．2．4 不同品种苹果叶片中Mal d 1的表达分析

2．2．5 Mal d 1基因时空表达分析

2．2．6 转基因愈伤组织抗病性鉴定

2．3 讨论

第三章 苹果Mal d 1基因的原核表达及纯化

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料

3．1．2 生物信息学分析

3．1．5 融合蛋白的诱导表达

3．1．6 融合蛋白的可溶性分析

3．1．7 融合蛋白的纯化

3．2 结果与分析

3．2．1 Mal d 1基因片段的扩增

3．2．2 Mal d 1蛋白序列分析及三维结构预测

3．2．3 原核表达载体的构建与鉴定

3．2．4 融合蛋白的诱导表达及纯化

3．3 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历