烟草西松烷二萜类化合物抗肿瘤作用研究

摘要

国内外研究表明，烟草中西松烷二萜具有良好的抑菌、抗肿瘤、神经保护活性。肝细胞癌作为死亡率居世界第二的恶性肿瘤，近年来发生率逐步上升。烟草中西松烷二萜抑制肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721的研究却鲜有报道。为探索烟草中西松烷二萜的抗肿瘤活性，充分利用烟草资源，本研究以α-2，7，11-西柏三稀-4，6-二醇（α-CBD）为对象，体外作用于肝癌HepG2、SMMC-7721细胞，探究其抗肿瘤活性。
　　1.经不同浓度的α-CBD处理肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、肝细胞株HL-770224 h、48h、72 h后，MTT法检测细胞活力，结果显示α-CBD对三种细胞均有活力抑制作用，且呈时间依赖性和浓度依赖性，但对于HL-7702细胞的活力抑制作用，稍弱于HepG2、SMMC-7721细胞。根据MTT结果，选定含有20 mg/Lα-CBD的培养液处理细胞，分别测定在24 h、48 h、72 h作用时间下HepG2、SMMC-7721细胞的克隆形成能力，HepG2细胞克隆形成率分别为80.92％、35.42％、6.10％，SMMC-7721细胞克隆形成率分别为76.63％、56.70％、29.13％，得出α-CBD能降低细胞克隆形成率的结论，说明α-CBD抑制肝癌细胞增殖。
　　2.通过吉姆萨染色在光镜下观察α-CBD处理后的HepG2、SMMC-7721细胞形态学变化，发现实验组细胞皱缩、变圆、体积缩小，从皿壁脱落，悬浮于培养液中，呈现凋亡形态。经AO/EB荧光双染色观察，对照组细胞呈均匀的绿色荧光，而实验组细胞出现不同程度的橙色、橘红色荧光，说明α-CBD改变了肝癌细胞的质膜通透性，可能诱导细胞凋亡。
　　3.通过对20 mg/Lα-CBD作用于HepG2细胞48 h的转录组表达水平研究，发现显著性差异表达基因3068个，其中上调基因1289个，下调基因1779个。差异基因GO富集分析显示，下调基因包括细胞连接、细胞迁移、有丝分裂、细胞周期、DNA复制中的DNA链延伸、生长因子结合等，抑制细胞的存活和增殖。上调基因中包括蛋白质定位、过渡金属离子、细胞死亡、细胞程序性死亡、凋亡进程、凋亡通路、泛素蛋白转移酶活性、内质网信号通路、蛋白质转运等，与促进细胞凋亡相关。差异基因KEGG通路富集分析显示，上调通路中包括NF-kB信号通路、HIF-1信号通路、凋亡、癌症通路、自噬调控通路，下调通路包括粘附连接、柠檬酸循环、p53信号转导通路、AMPK信号通路、TGE-β信号通路、P13K-Akt信号通路、细胞周期。通过凋亡通路基因分析，得出细胞的凋亡可能通过p53-PUMA、PI3K-Akt、IL-1-NFkB-IAP通路实现。
　　4.20 mg/Lα-CBD作用于HepG2细胞24 h、48 h、72 h后，流式细胞分析仪检测到HepG2细胞S期数分别为10.4％、16.9％、22.0％、29.8％，S期细胞数量明显增加，说明α-CBD对肝癌细胞的增殖抑制有赖于将细胞阻滞于S期，验证了转录组关于细胞周期阻滞的基因表达。流式细胞仪对HepG2细胞凋亡时相的检测结果显示，伴随α-CBD作用时间的增加，细胞凋亡率增加。得出α-CBD能够诱导HepG2细胞凋亡。选取六个差异表达的基因进行qRT-PCR验证，基因的表达趋势情况与DGE分析结果相符，说明DGE分析结果可靠。
　　综上所述，α-CBD能够降低肝癌细胞活力，抑制细胞增殖，改变质膜通透性，呈现凋亡形态，细胞周期S期阻滞，通过p53-PUMA、PI3K-Akt、IL-1-NFkB-IAP通路诱导细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物抗肿瘤活性成分

1．1．1 萜类

1．1．2 生物碱类

1．1．3 黄酮类

1．1．4 内酯类

1．1．5 醌类

1．1．6 多糖类

1．1．7 其他类

1．2 抗肿瘤作用机制

1．2．1 抑制肿瘤细胞增殖

1．2．2 诱导肿瘤细胞凋亡

1．2．3 影响肿瘤基因表达

1．2．4 其他作用机制

1．3 烟草西松烷二萜类化合物作为抗肿瘤药物的利用价值研究概况

1．3．1 我国烟草行业发展概况

1．3．2 烟草西松烷二萜类化合物活性的研究

1．4 研究目的和意义

1．5 技术路线

第二章 α-CBD对肝癌细胞的增殖抑制作用

2．1 试验材料与用品

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验药品与耗材

2．1．3 试验仪器

2．1．4 主要溶液的配方

2．2 试验方法

2．2．1 试验前的准备

2．2．2 肝癌细胞的MTT检测

2．3．2 SMMC-7721细胞的MTT检测

2．3．3 HL-7702细胞的MTT检测

2．3．4 HepG2细胞的细胞克隆形成能力检测

2．3．5 SMMC-7721细胞的克隆形成能力检测

2．4 讨论

第三章 α-CBD对肝癌细胞的形态学影响

3．1 试验材料与用品

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验药品与耗材

3．1．3 试验仪器

3．1．4 主要溶液的配方

3．2 试验方法

3．2．1 试验前的准备

3．2．2 肝癌细胞的吉姆萨染色

3．2．3 肝癌细胞的AO／EB荧光双染色

3．2．4 统计学分析

3．3 结果与分析

3．3．1 HepG2细胞的吉姆萨染色

3．3．2 SMMC-7721细胞的吉姆萨染色

3．3．3 HepG2细胞的AO／EB荧光双染色

3．3．4 SMMC-7721细胞的AO／EB荧光双染色

3．4 讨论

第四章 α-CBD诱导肝癌细胞周期阻滞和凋亡

4．1 试验材料与用品

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验药品与耗材

4．1．3 试验仪器

4．1．4 主要溶液的配方

4．2 试验方法

4．2．1 试验前的准备

4．2．2 肝癌细胞的周期检测

4．2．3 肝癌细胞凋亡的检测

4．2．4 统计学分析

4．3 结果与分析

4．3．2 α-CBD诱导肝癌细胞凋亡率上升

4．4 讨论

第五章 α-CBD对肝癌细胞转录组表达水平影响的研究

5．1 试验材料与用品

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验药品与耗材

5．1．3 试验仪器

5．1．4 主要溶液的配方

5．2 试验方法

5．2．1 细胞的处理

5．2．2 RNA的提取与纯化

5．2．3 cDNA的合成与纯化

5．2．4 体外转录合成生物素标记cRNA

5．2．5 cRNA纯化

5．2．6 cRNA质量检测

5．2．10 荧光实时定量PCR验证

5．2．11 统计学分析

5．3 结果与分析

5．3．1 基因表达水平分析

5．3．2 差异表达基因筛选

5．3．3 差异基因聚类分析

5．3．4 差异基因GO富集分析

5．3．5 差异基因KEGG通路富集分析

5．3．6 α-CBD调控凋亡关键基因表达水平改变

5．4 讨论

第六章 全文结论

6．1 结论

6．3 研究展望

参考文献

致谢

作者简历