工蜂劳动分工与蜂王浆高产机理的大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组研究

摘要

蜜蜂具有丰富的社会行为，大脑作为信息处理的最高中枢在蜜蜂行为的调控中发挥至关重要的作用。神经肽是在大脑神经信息传递过程中具有作用的活性生物多肽，通过在神经元、神经回路、组织器官水平上整合神经系统和其他系统的功能，最终在生长发育、代谢、生殖、求偶、觅食行为等方面发挥重要的调节功能。与此同时，大脑主要利用电信号和化学信号传输信息，多种类型的膜蛋白，如受体蛋白、通道蛋白、转运蛋白等在信号传导中发挥不可或缺的作用，而膜蛋白的磷酸化修饰在蛋白功能和信号传导中发挥广泛而且精细的调控作用。然而，关于大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组在工蜂行为调控中的研究还未见报道。本研究针对蜜蜂成年工蜂中存在的与日龄相关的劳动分工现象，以工蜂不同发育时期的大脑为研究对象并选取了意大利蜜蜂（原意）和蜂王浆高产蜜蜂（浆蜂）两个品系，利用非标记蛋白质组学定量、膜蛋白提取、磷酸化富集、生物信息学分析等手段开展了工蜂大脑神经肽和膜蛋白在行为调控中的研究。
　　在工蜂大脑发现的22种神经肽前体蛋白中鉴定到158条非冗余的神经肽，其中77条为首次鉴定，显著提高了蜜蜂神经肽组的覆盖率。在工蜂不同发育时期，14类神经肽家族动态调节工蜂生理以适应不同阶段劳动分工的需要，尤其是在采集蜂时期加强了代谢、运动、生物节律等方面生理调控以适应巢外采集工作。对原意和浆蜂大脑神经肽组的定量比较发现，浆蜂的神经肽组发生了重构，以适应蜂王浆高产的需要，其中利尿激素(DH)和外周神经激肽(PVK)通过加强浆蜂哺育蜂水分和离子平衡的调控为蜂王浆分泌量提高提供了有力的支撑;速激肽(TK)在嗅觉识别调控中发挥重要的负调控作用，其在浆蜂中的低表达有利于浆蜂对幼虫的识别，同时加强了对花粉的采集，保障了蜂王浆分泌对蛋白质的需求，从而促进了蜂王浆分泌量提高。
　　膜蛋白作为信号传递的受体在蜜蜂大脑调控行为中具有重要功能，我们在不同发育阶段的蜜蜂大脑中鉴定到1079种膜蛋白，它们主要参与氧化磷酸化、内质网蛋白质加工、溶酶体等十个重要通路，其中氧化磷酸化途径主要为大脑神经元功能提供能量保障，而内质网蛋白质加工通路能够为各种酶、神经肽、突触以及囊泡的膜蛋白组件的合成和加工提供分子基础。为了满足工蜂不同发育阶段大脑生理功能的需要，大脑膜蛋白质组处于动态变化之中。在成年工蜂发育早期，碳水化合物、核甘酸和脂类代谢相关的膜蛋白上调表达为神经元的增殖、迁移等提供物质和能量支持，促进大脑结构和功能的完善;采集蜂在巢外从事采集工作面对多变的外部环境，其大脑需要处理复杂的视觉、嗅觉、以及触觉信息，此时上调表达的膜蛋白种类最多，且主要是通过增强神经元之间的信号传导加强行为调控并帮助采集蜂更高效的处理信息。通过对原意和浆蜂膜蛋质组的比较发现，浆蜂大脑膜蛋白加强了对哺育和采集行为的调控，进而支持蜂王浆高产的需要。在哺育蜂阶段，浆蜂大脑中的磷脂酰肌醇信号通路和花生四烯酸信号通路的功能得到加强，有利于提高对幼虫信息素的识别，进而提高台基接受率，这是蜂王浆高产的前提;在采集蜂阶段，浆蜂大脑中与神经信号传导相关的通路功能得到加强，如:SNARE在囊泡运输中的互作，wnt信号通路，TGF-beta信号通路等，增强了采集蜂对花粉的采集力，为蜂群提供充足的蛋白质食物以满足哺育蜂分泌蜂王浆对蛋白质的需求。
　　通过对工蜂大脑膜蛋白磷酸化修饰的鉴定和分析发现，其磷酸化修饰主要在MAPKs，CDKs和CK2这几类激酶的催化下完成。在工蜂大脑发育不同时期，磷酸化参与调控的重点也有所不同，幼蜂期主要促进神经元的发育和突触功能的成熟，成蜂期主要加强哺育蜂和采集蜂大脑神经元离子传输和信号传导。原意和浆蜂大脑的膜磷酸化蛋白质组的比较发现，浆蜂中上调表达的磷酸化蛋白数目更多说明磷酸化在浆蜂大脑功能中的调控作用更加活跃。尤其是在哺育蜂和采集蜂时期，转运蛋白磷酸化水平显著提升表明神经元信号传导能力在浆蜂中得到加强，从而更有利于对哺育和采集行为的调控，为蜂王浆分泌量的提升提供保障。
　　本研究通过对工蜂大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组的分析，深入解析了蜜蜂行为的神经调控和蜂王浆高产分子基础。在多维组学水平上全面阐释了神经肽、膜蛋白、膜磷酸化蛋白调节蜜蜂劳动分工行为和浆蜂蜂王浆高产的神经生物学机理。这不仅是对蜜蜂神经生物学的理论创新，同时也为其它昆虫在该领域的研究提供了借鉴。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 神经生物学与蜜蜂行为调控

1．2 昆虫神经肽研究进展

1．3 蜂王浆高产机理研究进展

1．4 蜜蜂磷酸化蛋白质组学研究进展

1．5 研究目的及主要研究内容

1．5．1 研究目的

1．5．2 主要研究内容

第二章 工蜂大脑神经肽组学研究

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 实验流程

2．1．2 实验材料

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 幼虫接受率，产浆量和花粉采集量测定

2．2．2 神经肽的提取

2．2．3 样品脱盐

2．2．4 多肽定量

2．2．5 LC-MS／MS分析

2．2．6 神经肽鉴定与定量分析

2．2．7 荧光定量PCR

2．2．8 Western blot分析

2．3 实验结果

2．3．1 幼虫接受率，产浆量和花粉采集量测定

2．3．2 工蜂大脑神经肽组鉴定

2．3．3 工蜂大脑神经肽组定量比较

2．3．4 神经肽前体蛋白转录水平比较

2．3．5 Western blot验证结果

2．4 讨论

2．4．1 蜜蜂大脑神经肽组的覆盖率大幅提升

2．4．2 神经肽组动态调控工蜂的生理变化以适应劳动分工

2．4．3 神经肽与蜂王浆分泌行为调控相关

2．5 结论

第三章 工蜂大脑膜蛋白质组学研究

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 实验流程

3．1．2 实验材料

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 膜蛋白的提取

3．2．2 蛋白质浓度测定

3．2．3 膜辅助的蛋白质酶解

3．2．4 样品除盐

3．2．5 多肽定量

3．2．6 LC-MS／MS分析

3．2．7 蛋白鉴定与定量分析

3．2．8 生物信息学分析

3．2．9 荧光定量PCR

3．3 实验结果

3．3．1 工蜂大脑膜蛋白质组鉴定

3．3．2 成年工蜂发育过程中大脑膜蛋白质组变化

3．3．3 原意与浆蜂大脑膜蛋白质组差异比较

3．3．4 差异表达膜蛋白基因水平验证

3．4 讨论

3．4．1 工蜂大脑膜蛋白质组的鉴定

3．4．2 大脑膜蛋白质组参与工蜂劳动分工中的行为调控

3．4．3 大脑膜蛋白质组参与蜂王浆分泌的行为调控

3．5 结论

第四章 工蜂大脑膜磷酸化蛋白组学研究

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 实验流程

4．1．2 实验材料

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 膜蛋白的提取

4．2．2 蛋白质浓度测定

4．2．3 膜辅助的蛋白质酶解

4．2．3 磷酸化肽段富集

4．2．4 样品除盐

4．2．5 多肽定量

4．2．7 生物信息学分析

4．3 实验结果

4．3．1 工蜂大脑膜磷酸化蛋白质组鉴定

4．3．2 成年工蜂发育过程中大脑膜磷酸化蛋白质组变化

4．3．3 原意与浆蜂大脑膜磷酸化蛋白质组差异比较

4．4 讨论

4．4．1 工蜂大脑膜磷酸化蛋白及其motif鉴定

4．4．2 膜蛋白磷酸化在工蜂大脑发育过程中的调控作用

4．4．3 膜蛋白磷酸化在产浆生物学中的调控作用

4．5 结论

第五章 结论及展望

5．1 全文结论

5．2 创新之处及新发现

5．3 展望

参考文献

致谢

作者简历