大丽轮枝菌致病相关基因VdNOP12及VdLHS1的功能分析

摘要

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）属于半知菌类轮枝孢属真菌，寄主范围极广，可引起200多种双子叶植物的黄萎病;其中由其引起的棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”，是制约我国棉花生产的主要因素之一。虽然目前棉花黄萎病的侵染循环比较清楚，但是由于大丽轮枝菌的微菌核在土壤中存活时间长、抗病育种滞后和缺乏环境友好且防治效果好的杀菌剂等因素导致该病害目前尚无有效的防治手段。研究大丽轮枝菌的致病机理是设计有效防治策略的基础性工作。
　　本研究以落叶型大丽轮枝菌Vd991的T-DNA插入突变体库为材料，对其中294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力筛选，共获得9个与野生型Vd991菌株相比致病力显著降低的突变体。Southern杂交结果表明9个突变体中只有1个突变体的T-DNA为双拷贝插入，其余8个突变体均为单拷贝插入，单拷贝插入率为88.9％。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的变化。借助hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术和VdLs.17基因组数据明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布;并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因，为后续进行基因功能的深入研究奠定了基础。
　　在此基础上对M11H01突变体开展了进一步的研究，发现该突变体的T-DNA破坏了一个假设基因的表达。序列比对分析发现该基因编码的蛋白与酵母中的低温敏感的NOP12具有一定的相似性，因此将该基因命名为VdNOP12。因此，通过不同温度梯度对T-DNA突变体、敲除突变体和野生型菌株进行低温敏感性测试，结果表明无论是T-DNA突变体还是敲除突变体ΔVdNOP12在低温胁迫下的生长速率与野生型相比明显下降，表明该基因参与了大丽轮枝菌的低温胁迫响应。产孢量测定表明该基因在正常生长温度下就可以显著降低大丽轮枝菌的产孢量;亚细胞定位分析表明该基因定位于大丽轮枝菌的细胞核中;致病力测定分析表明在正常生长温度下，突变体的致病力与野生型相比也有显著下降。上述结果表明该基因不仅与大丽轮枝菌的低温敏感性有关而且还与大丽轮枝菌的产孢量和致病性存在相关性。
　　大丽轮枝菌分泌的细胞壁降解酶(CWDE)被认为在该菌的致病过程中发挥重要作用，然而这些CWDE是如何分泌到细胞外的却不甚了解。因此我们对已报道的稻瘟病菌的MoLHS1在大丽轮枝菌中的同源蛋白VdLHS1的功能开展了研究。亚细胞分析表明VdLHS1可以与Blue-WhiteDPX共定位于大丽轮枝菌的内质网上。生长表型测定表明VdLHS1敲除以后会导致大丽轮枝菌的营养生长和产孢量明显降低。致病力测定表明棉花接种ΔVdLHS1突变体以后其病情指数显着低于对照野生型菌株接种的棉花。胁迫测试表明该基因不参与大丽轮枝菌的胁迫响应过程。胞外酶活测定表明与野生型相比，ΔVdLHS1突变体分泌纤维素酶，木质素酶，漆酶，果胶酶和木聚糖酶的活性显著降低，而淀粉酶和β-葡糖苷酶的活性没有明显变化;但是ΔVdLHS1突变体中的蛋白酶活性却显著高于野生型菌株。上述研究结果表明VdLHS1可能通过影响大丽轮枝菌胞外酶的分泌和产孢量来影响大丽轮枝菌的致病性。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 绪论

1．1 大丽轮枝菌的生长及危害

1．1．1 大丽轮枝菌的形态

1．1．2 大丽轮枝菌的致病机理及研究现状

1．2 Y-DNA插入突变体研究进展

1．2．1 ATMT法转化机理

1．2．2 hiTAIL-PCR与T-DNA片段插入位点侧翼序列分析

1．3 温度相关基因功能研究进展

1．3．1 生物中温度应激诱导基因

1．3．2 酵母中温度敏感基因研究进展

1．3．3 温度敏感缺陷基因在丝状真菌中研究进展

1．3．4 大丽轮枝菌和温度关系

1．4 分泌系统调节蛋白与致病力关系研究进展

1．4．1 分泌系统调节蛋白在细菌中的研究进展

1．4．2 分泌系统调节蛋白在真菌中的研究进展

1．4．3 大丽轮枝菌中分泌系统调节蛋白的研究进展

第二章 大丽轮枝菌T-DNA插入突变体的筛选及鉴定

2．1 实验材料试剂及仪器软件

2．1．1 实验材料及试剂

2．1．2 仪器软件

2．2 实验方法

2．2．1 大丽轮枝菌活化培养

2．2．2 致病力测定

2．2．3 生物学特性测定

2．2．4 致病缺陷型突变体的分子验证

2．2．5 致病缺陷型突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆与分析

2．2．6 致病相关基因的克隆

2．3 实验结果

2．3．1 致病缺陷型突变体的筛选

2．3．2 致病缺陷型突变体的分子检测

2．3．3 致病缺陷型突变体的生物学表型分析

2．3．4 致病缺陷型突变体的T-DNA插入位点侧翼序列分析

2．3．5 致病相关基因克隆与分析

2．4 讨论

第三章 VdNOP12的初步研究

3．1 实验材料试剂及仪器软件

3．1．1 实验试剂材料

3．1．2 供试棉花品种、菌株和质粒

3．1．3 实验仪器软件

3．2 实验方法

3．2．1 拷贝数验证及基因表达分析

3．2．2 敲除、回补突变体菌株的构建及分析

3．2．3 突变株致病力的鉴定

3．2．4 生物学测定

3．2．5 细胞核DAPI染色

3．2．6 不同胁迫条件下生长表型

3．2．7 不同温度梯度下生长直径检测

3．2．8 本实验中所用引物列表

3．3 实验结果

3．3．1 T-DNA插入突变体发病情况

3．3．2 T-DNA插入突变体位点检测

3．3．3 敲除、回补突变体及其分析

3．3．4 致病力鉴定

3．3．5 VdNOP12亚细胞定位

3．3．6 生物学测定

3．3．7 非生物胁迫条件下生长表型

3．3．8 不同温度梯度生长表型检测

3．4 讨论

第四章 VdLHS1的初步研究

4．1 实验材料、试剂及仪器

4．2 实验方法

4．2．2 回补菌株的构建

4．2．3 ER-Tracker染色

4．2．4 生物学分析

4．2．5 不同胁迫条件的影响

4．2．6 致病力鉴定与分析

4．2．7 分泌酶的检测

4．2．8 本实验所用引物列表

4．3 实验结果

4．3．1 VdLHS1基因克隆及聚类分析

4．3．2 敲除、回补质粒的构建及转化子鉴定

4．3．3 亚细胞定位

4．3．4 生物学特性分析

4．3．5 外界非生物胁迫分析

4．3．6 致病力鉴定及分析

4．3．7 分泌酶的检测

4．4 讨论

第五章 全文总结与展望

参考文献

附录

致谢

作者简历