植物SWEET基因家族Clade Ⅰ基因功能研究

摘要

糖转运蛋白SWEET(sugars will be eventually effluxed transporter参与源到库的糖运输、花蜜分泌、植物衰老、植物抗逆、病原体的营养等重要的生理过程。本课题主要研究玉米(Zea may L.)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)SWEET基因家族的CladeⅠ亚家族成员的生化功能，包括玉米SWEET1b和拟南芥的AtSWEET1/2/3基因。
　　本项目首先研究了玉米SWEET1b的生化功能。前期研究中获得一个玉米发育后期早衰突变体，图位克隆发现是因为玉米SWEET1b基因单碱基突变导致。通过玉米原生质体转化和烟草瞬时表达实验结果表明SWEET1b蛋白定位在原生质膜，并且突变不影响SWEET1b的定位。通过玉米的遗传转化，将SWEET1b与eYFP(enhanced yellow fluorescent protein)融合表达的载体转入玉米中，进行组织器官定位，定位结果显示SWEET1b特异性的在玉米气孔副卫细胞膜上表达。双分子荧光互补验证了属于SWEET家族的SWEET1b蛋白也具有形成二聚体的能力，但突变后不能形成二聚体的形式。SWEET1b基因在自然群体中具有较高的多态性，存在大片段的插入或缺失，以及碱基的多态性，但是在进化过程中仍存在较多保守区域。为了更深入的理解玉米SWEET1b，我们同时对拟南芥AtSWEET1/2/3进行了研究。利用CRISPR/Cas9系统获得了拟南芥AtSWEET1/2/3基因不同组合的突变体，分别敲除了sweet1，sweet1/2，sweet3，sweet1/2/3。通过对突变体和野生型角果长度的测量，发现突变后角果长度变短，且差异极显著，但是不同突变体之间差异不明显。在测定不同糖浓度敏感实验中，突变体sweet1，sweet1/2，sweet1/2/3对6.0％葡萄糖敏感，sweet3不敏感，四种突变体对果糖都不敏感，并且KIN10，KIN11的表达量都有所下降。
　　本研究的结果显示在玉米中SWEET1b可形成二聚体结构并且定位在气孔的副卫细胞，拟南芥中AtSWEET1/2/3突变后可导致角果变短，并且部分突变体对6.0％葡萄糖敏感。这表明玉米SWEET1b和拟南芥AtSWEET1/2/3在其生长发育中可能发挥重要的作用，为解释SWEET1b突变后玉米出现的早衰性状指明了方向，也为玉米的育种工作提供理论基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1．1 拟南芥SWEET基因家族研究进展

1．1．2 玉米SWEET基因研究进展

1．1．3 水稻SWEET基因研究进展

1．2 CRISPR／Cas9基因编辑技术研究概况

1．3 本研究的目的及意义

第二章 玉米SWEET1b基因定位及多态性研究

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 本实验所用的菌株和载体说明

2．1．3 生化试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 实验中所用到的引物

2．2 实验方法

2．2．1 植物材料的种植

2．2．2 CTAB法提取基因组DNA和Tdzo1提取总RNA

2．2．3 载体构建方法

2．2．4 玉米原生质体瞬时转化

2．2．5 烟草的瞬时表达分析

2．2．6 转基因玉米植株eYFP观察

2．2．7 双分子荧光互补

2．2．8 SWEET1b基因在玉米自交系群体中的多态性

2．2．9 SWEET1b进化分析

2．3 结果与分析

2．3．1 玉米SWEET1b蛋白的亚细胞定位和组织器官定位

2．3．2 双分子荧光互补结果与分析

2．3．3 SWEET1b基因在玉米自然群体中的多态性

2．3．4 SWEET1b进化分析结果

2．4 本章结论与讨论

2．4．1 本章结论

2．4．2 本章讨论

第三章 CRISPR／Cas9介导的拟南芥SWEET1／2／3基因敲除研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 本实验所用的菌株和载体

3．1．3 生化试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 实验中所用到的引物

3．2 常用培养基配置

3．3 相关试剂配置

3．3．1 拟南芥基因组DNA提取所需试剂

3．3．2 农杆菌侵染液的配制

3．4 试验方法

3．4．1 拟南芥的种植

3．4．2 花序侵染法稳定转化拟南芥

3．4．3 拟南芥转基因阳性植株的筛选

3．4．4 PCR检测拟南芥阳性植株

3．4．5 突变体角果长度测定实验

3．4．6 转基因拟南芥在不同糖浓度的平板上生长实验

3．4．7 突变体中不同糖转运相关基因的表达情况

3．4．8 反转录

3．4．9 实时荧光定量PCR检测

3．5 结果与分析

3．5．1 转基因拟南芥的获得及检测

3．5．2 突变体角果长度测定

3．5．3 突变体在不同糖浓度的培养基上的生长实验

3．5．4 突变体中不同糖转运相关基因的表达情况

3．6 本章结论与讨论

3．6．1 本章结论

3．6．2 本章讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历