AtDCGS和β-Zein共表达转基因大豆材料创制及其对蛋氨酸积累的影响

摘要

大豆(Glycine max(L.)Meer.)是世界上重要的粮油兼用作物，其蛋白质含量高、成本低，是人类和家畜优质的植物蛋白质来源，具有重要的经济价值。然而，与其它来源于植物中的蛋白相似，大豆蛋白中的必需氨基酸蛋氨酸含量较低，无法满足人类和家畜的营养需求，限制了它的营养价值。因此，提高大豆蛋白中蛋氨酸的含量，对于提高大豆营养品质，改善人类膳食营养以及促进畜牧业发展具有重要的实用价值。
　　本研究一方面利用过表达蛋氨酸合成关键酶基因AtDCGS的转基因大豆材料，与过表达富含蛋氨酸的玉米β-Zein储藏蛋白编码基因的转基因大豆材料进行杂交，将两个基因进行聚合。另一方面，构建同时携带AtDCGS和β-Zein基因的双价表达载体，进行大豆全株转化，从而获得共表达这两个外源基因的转基因大豆材料。对双价转基因大豆材料进行了除草剂抗性筛选、PCR检测、目的基因表达量检测及Southern blot检测，并在温室和田间种植进行加代和筛选。目前，通过杂交获得了10个F3代双价转基因大豆株系，通过转化双价表达载体获得了45个T3代双价转基因大豆株系，筛选到了CZ-6和CZ-9两个目的基因表达量高、外源基因拷贝数低且无表型异常的双价转基因株系。
　　对部分T2代双价转基因大豆株系和F2代双价转基因大豆株系及其亲本的种子进行了蛋氨酸含量的检测。结果发现，与野生型相比，转AtDCGS基因的大豆籽粒中游离蛋氨酸含量最大提高到3.3倍，且种子特异型表达比组成型表达提高幅度更大。在共表达两种外源基因的转基因材料中，游离蛋氨酸含量比只转AtDCGS基因的亲本降低，同时总蛋氨酸含量比只转β-Zein基因的亲本进一步提高，推测部分降低的游离蛋氨酸用于了储藏蛋白的合成。与野生型相比，双价转基因大豆籽粒总蛋氨酸含量最大提高了22％。以上实验结果表明，通过结合蛋氨酸合成和储藏两条途径，可以进一步增加大豆籽粒内蛋氨酸的积累。
　　检测了野生型和部分转基因大豆种子总蛋白和脂肪含量，结果发现蛋氨酸含量的提高伴随着大豆籽粒蛋白的显著增加，同时脂肪含量降低，推测游离蛋氨酸含量的不足是限制大豆蛋白积累的重要因素。因此，提高大豆籽粒内蛋氨酸含量，对于改善大豆蛋白的品质和含量都具有积极的影响。
　　本研究通过基因工程的手段，从大豆蛋氨酸合成和储藏两方面进行调控，提高了大豆籽粒储藏蛋白中蛋氨酸的含量，改善了大豆蛋白的品质，同时也为其它作物的品质改良提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物体内蛋氨酸的代谢调控

1．1．1 植物体内蛋氨酸合成与代谢

1．1．2 CGS的表达调控

1．2 提高植物体内蛋氨酸含量的方法及进展

1．2．1 蛋氨酸合成代谢通路的调控

1．2．2 储藏蛋白编码基因的调控

1．2．3 蛋氨酸代谢调控编码基因与富含蛋氨酸的储藏蛋白编码基因的聚合

1．3 本研究的目的与意义

第二章 杂交创制共表达AtDCGS和β-Zein基因的大豆材料

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 种植条件

2．2．2 杂交方法

2．2．3 转基因大豆材料除草剂筛选

2．2．4 大豆基因组DNA提取

2．2．5 目的基因PCR检测

2．3 结果与分析

2．3．1 杂交亲本及子代统计

2．3．2 除草剂筛选及试纸条检测结果

2．3．3 PCR检测结果

2．4 讨论

第三章 双价表达载体转化创制共表达AtDCGS和β-Zein基因的大豆材料

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与载体

3．2 实验方法

3．2．1 液体及固体培养基配制

3．2．2 菌落培养及菌液PCR

3．2．3 质粒提取

3．2．4 双价表达载体的构建

3．2．5 冻融法转化大肠杆菌

3．2．7 EHA101农杆菌电击转化

3．2．8 转基因大豆全株的转化与鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 表达载体构建

3．3．2 转基因材料的鉴定与筛选

3．4 讨论

第四章 共表达AtDCGS和β-Zein基因的大豆材料的筛选、加代及品质鉴定

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 Southern blot与基因组整合鉴定

4．2．2 RNA提取与转录水平检测

4．2．3 SDS-PAGE蛋白水平检测

4．2．4 氨基酸含量检测

4．2．5 总蛋白及脂肪含量检测

4．3 结果与分析

4．3．1 Southern blot检测

4．3．2 转录水平检测

4．3．3 SDS-PAGE检测

4．3．4 蛋氨酸含量检测

4．3．5 游离氨基酸含量检测

4．3．6 总蛋白及脂肪含量的检测

4．4 讨论

4．4．1 基因工程手段提高大豆蛋氨酸含量

4．4．2 大豆蛋氨酸含量的提高对其它相关氨基酸的影响

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历