脂质转运蛋白基因BraLTP2在甘蓝型油菜中超量表达导致表皮毛密度的增加和次级代谢物含量的改变

摘要

由于气候变化、环境污染等不良环境因素导致的逆境胁迫包括紫外线辐射、干旱、淹水、高低温、盐碱、重金属、病害和虫害等，都给油菜的生产带来了严重的负面影响。随着油菜全基因组测序的完成，油菜基因的功能挖掘对于油菜抗逆功能的研究具有重要的理论和实际意义。我们在前期研究的基础上，发掘到一个与油菜叶片表皮毛发育相关的基因，继而与植物抗逆可能具有密切联系的nsLTP家族基因，拟通过对该基因在这些过程中的功能及作用机制进行剖析，初步揭示该基因抗逆的功能。早已证实植物表皮毛作为植物表面抵抗外界不良环境的天然屏障，同时表皮毛是次级代谢产物生物合成与分泌的“生化工厂”，同植物抵抗逆境密切相关。众多研究表明，nsLTP家族基因确实可能在植物表皮毛生长发育和表皮毛次级代谢方面从而在逆境胁迫过程中起到重要作用。本研究的目的是为了探明该基因具体参与表皮毛生长发育的哪个环节，具体影响表皮毛中哪些种类的次级代谢物，以及在哪些逆境胁迫方面具有一定的抗逆性。
　　为了开展相关研究，本课题开展了以下研究工作:
　　1、BraLTP2基因基本功能特征分析
　　通过生物信息学方法对BraLTP2基因及同源基因进行保守结构域预测、保守位点分析、信号肽预测和启动子调控元件分析。结果显示，BraLTP2基因与油菜中的BnaLTP1具有99％的同源性，与拟南芥中的AtLTP1具有76％的同源性。蛋白特征分析显示，其具有该家族蛋白所共有的保守结构，8个半胱氨酸残基并形成4个二硫键。进一步的研究是通过构建启动子分析载体，利用农杆菌介导的遗传转化体系，获得转基因材料，分析BraLTP2基因的时空表达规律。我们重点关注在叶片及其表皮毛部位的表达，组织化学染色结果显示，BraLTP2基因在叶片表皮毛部位具有时空表达特异性。另外，通过构建BraLTP2∷GFP融合表达载体，分析BraLTP2蛋白的亚细胞定位。镜检观察结果显示，该蛋白定位在表皮细胞胞外和表皮毛边缘位置。
　　2、BraLTP2基因在表皮毛生长发育方面的研究
　　为了揭示BraLTP2基因在表皮毛生长发育过程中的功能特点，我们通过构建BraLTP2超量表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法获得BraLTP2超表达转基因油菜植株，并进行分子生物学鉴定。通过对其中6个株系的转基因油菜进行相对表达量的测定，我们选取35S∷BraLTP2-3和35S∷BraLTP2-4两个株系进行表型鉴定。通过显微镜和扫描电镜观察，确定超表达BraLTP2基因后，转基因油菜叶片表皮毛密度发生了显著的增加，相同叶面积的转基因油菜叶表皮毛数量增加20倍以上。但是在株高，植株形态以及表皮毛性状方面同对照组没有差异。因此我们推断，该基因特异性调节表皮毛生长和发育过程，主要集中体现在改变了表皮毛的密度。
　　3、超量表达BraLTP2基因对油菜次级代谢物的影响
　　利用基于LC-MS/MS平台的广泛靶向代谢组学技术，比较BraLTP2超表达转基因油菜和野生型油菜叶片次级代谢物组成与含量的差异。检测结果显示，共发现89种差异代谢物，其中43种含量显著上调的次级代谢物可以分为7大类，包括黄酮类、苯丙素类、酚胺类、生物碱类、萜类、有机酸类和其他次级代谢物类。我们发现与抗逆相关的次级代谢物含量变化差异显著，例如黄酮类、苯丙素类、酚胺类和生物碱类等物质。该部分实验研究揭示了超表达BraLTP2基因影响油菜叶片次级代谢物的组成和含量，推断BraLTP2功能涉及次级代谢物的合成或积累。
　　4、BraLTP2基因在抗逆功能方面的研究初探
　　结合BraLTP2基因的基本功能特征及其在油菜表皮毛生长发育、代谢水平方面的研究结果，推断该基因可能具有一定的抗氧化特性。我们测定转基因和野生型植株在不同浓度的MV溶液胁迫处理下种子萌发率、幼苗生长过程中株高和根长等性状的差异。结果显示，在强氧化剂的胁迫处理下，相对于野生型而言，BraLTP2超表达转基因油菜种子萌发率受到轻微的影响，但是测定结果并未达到统计学上显著性的水平。幼苗的株高和根长，也未达到统计学上的显著性水平。我们进一步在MV胁迫下测定五大类抗氧化酶CAT、APX、GR、POD和SOD的活性。结果显示，在35S∷BraLTP2转基因植物叶片中，CAT、APX、POD和SOD等主要抗氧化酶的活性均有显著提高，进一步证明了该基因的抗氧化功能。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物非特异性脂质转运蛋白(nsLTPs)概述

1．1．1 植物非特异性脂质转运蛋白(nsLTPs)的概念及分类

1．1．2 植物非特异性脂质转运蛋白(nsLTPs)的功能

1．1．3 植物非特异性脂质转运蛋白研究存在的问题

1．2 植物表皮毛的研究简介

1．2．1 表皮毛的分类和形态

1．2．2 植物表皮毛功能的研究进展

1．2．3 植物表皮毛相关基因的研究及其进展

1．3 植物表皮毛与非特异性脂质转运蛋白的研究进展

1．3．2 nsLTP家族基因在植物表皮毛次级代谢过程中的作用及其研究进展

1．4 本文研究意义及技术路线

第二章 所碰脚基因序列分析和表达规律研究

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料、菌株及质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 BraLTP2基因克隆及序列分析

2．1．4 BraLTP2基因的启动子分析载体

2．1．5 BraLTP2 GFP融合基因分析载体

2．2 结果与分析

2．2．1 BraLTP2基因和蛋白的特征

2．2．2 BraLTP2基因启动子片段的克隆及组化分析

2．2．3 BraLTP2基因的亚细胞定位表达分析

2．3 讨论与总结

2．3．2 BraLTP2的时空表达和亚细胞定位分析

第三章 BraLTP2基因超表达和表型研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．3 转基因植株的分子鉴定

3．1．4 转基因植物的表型观察

3．2 结果与分析

3．2．1 农杆菌介导油菜遗传转化与鉴定

3．2．2 转基因植株相对表达量的分析

3．2．3 转基因油菜叶片的表皮毛观察与分析

3．3 讨论与总结

第四章 超量表达BraLTP2基因对次级代谢物的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 质谱定性定量分析

4．2．2 代谢组数据和差异代谢物分析

4．3 讨论与总结

第五章 BraLTP2基因在油菜中抗逆功的初步研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法

5．1．3 油菜抗逆效果鉴定

5．2 结果与分析

5．2．1 转基因油菜抗氧化逆境胁迫对表型的影响

5．2．2 MV处理对野生型和转基因油菜株系生理指标的影响

5．3 讨论和总结

第六章 全文总结

6．2 BraLTP2基因在表皮毛发育、次级代谢以及抗逆功能方面的作用初探

参考文献

附录

致谢

作者简历