规模化猪场粪污中典型抗生素归趋行为及抗性基因扩散特征研究

摘要

养殖业耐药性扩散是危害公共健康的全球性问题，而生猪养殖是主要的耐药性扩散源头之一。长期以来，我国的生猪养殖行业大量使用抗生素导致耐药基因从畜牧生产系统向农业生产系统呈现扩散趋势，存在进入食物链诱发耐药疾病风险。因此，有必要针对规模化生猪养殖粪污处理和利用过程，研究抗生素和耐药基因的污染特征及分布规律，科学评估养殖环境耐药性扩散风险。本研究在全国范围选取22个规模化生猪养殖场及周边环境作为研究对象，开展了以下研究:①针对13个养殖场系统分析抗生素、耐药基因和耐药菌在粪便、污水、粪肥还田土壤中的分布特征和污染现况，以及环境因子（抗生素和理化特性）对耐药性扩散的影响效应;②针对华北地区9个典型生猪养殖场及周边地下水环境，评估抗生素和耐药基因的扩散风险。主要的研究结果如下:
　　(1)基于对全国13个典型生猪养殖监测点的调查，利用LC-MS/MS检测并分析四环素、磺胺、喹诺酮和大环内酯类等18种常用抗生素在粪便、污水及还田土壤等环境介质中的含量水平和污染特征。结果显示，不同地区抗生素分布特征有所区别，但四环素、磺胺和喹诺酮类抗生素在生猪养殖场使用最为广泛，其中四环素、土霉素、多西环素、磺胺嘧啶、磺胺甲嗯唑、磺胺间甲氧嘧啶、氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星在粪污和土壤中残留量最高;常规污水处理工艺对抗生素去除效果有限，处理后外排水中仍残留多种高浓度抗生素，存在环境污染风险;还田土壤抗生素检出水平均明显低于粪便，且粪便和土壤抗生素组成表现出一定的相似性，而对照土壤样品并未检测出任何抗生素残留。
　　(2)利用实时荧光定量PCR检测并分析17种常见耐药基因的丰度变化，解析环境因子对耐药基因分布的影响。结果显示，粪便、污水和土壤含有大量耐药基因，除ermB、qnrA和qnrB三种耐药基因外，其它耐药基因的检出率均达到100％,污水处理工艺无法有效去除耐药基因，粪肥还田可诱导耐药基因增加，存在耐药性扩散风险;粪便、污水和土壤中耐药基因的丰度变化与抗生素浓度水平间不存在显著相关性，部分耐药基因在无抗生素诱导条件下仍然具有较高的丰度;四环素、喹诺酮、Zn和TP对粪便和土壤中tetO、tetW、ermB和mefA/E等耐药基因表现出共同选择效应。耐药基因定量和分布特征的结果表明，即便减少或禁止使用抗生素，仍可能存在耐药性扩散风险。
　　(3)利用高通量测序分析细菌16SrRNA基因多样性，揭示粪便、污水和粪肥还田土壤耐药菌群落组成和分布特征，以及环境因子对耐药菌分布和演替的影响。稀缺偏最小二乘回归结果显示，421个OTUs与耐药基因相对丰度存在相关性，其中68个OTUs相对丰度≥001％，可能是潜在的风险耐药菌;在门水平上这些耐药菌主要归属于放线菌(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，在属水平上则表现出丰富的多样性;粪便、污水和土壤中抗生素浓度水平对耐药菌组成和分布均有显著影响，但理化性质差异仅对粪便和土壤耐药菌的组成和分布具有显著影响。
　　(4)针对规模化猪场污水中抗生素残留向地下水环境扩散的风险问题，研究了养殖场及周边地下水环境磺胺、喹诺酮和四环素类兽药抗生素残留的污染特征，以及抗生素含量和耐药基因拷贝数间的相关性。结果显示，在受检猪场及周边村镇水井采集的18个地下水样中有14个检出抗生素残留，检出率为78％，检出的抗生素包括:泰乐菌素、金霉素、土霉素、恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等，含量变化范围在022-2223μg/L之间;采用PCA排序和层次聚类分析，初步判断兽药抗生素可从猪场所在场址渗入地下水体并进一步扩散进入周边村镇地下水环境，存在公共健康风险。地下水中可检测到多种耐药基因，其中qnrA、tetG、tetM和tetO的拷贝数与抗生素浓度存在明显的线性关系。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 选题背景

1．2 兽用抗生素主要类型、使用现状与环境分布

1．2．1 抗生素种类与作用机制

1．2．2 兽药抗生素使用现状

1．2．3 兽药抗生素的环境分布

1．2．4 畜禽粪污中抗生素扩散风险

1．3 耐药性原理与转移机制

1．3．1 耐药性机制

1．3．2 耐药性基因的来源与传播

1．3．3 影响耐药基因环境分布的因素

1．4 研究意义与内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

第二章 规模化生猪养殖环境中抗生素残留的污染特征

2．1 材料与方法

2．1．1 监测点布局

2．1．2 样品采集

2．1．3 标准样品及试剂

2．1．4 实验仪器与耗材

2．1．5 常规理化指标

2．1．6 抗生素检测方法

2．1．7 检测方法评价

2．2 结果

2．2．1 污水中抗生素残留和分布特征

2．2．2 粪便和土壤抗生素残留和分布特征

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 生猪养殖环境耐药基因的分布特征及影响因素

3．1 材料与方法

3．1．1 实验试剂与仪器

3．1．2 DNA的提取

3．1．3 耐药基因PCR扩增

3．1．4 统计分析

3．2 结果

3．2．1 耐药基因分布特征

3．2．2 耐药基因与环境因素相关性分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 生猪养殖环境耐药相关微生物群落演变特征

4．1 材料与方法

4．1．1 DNA提取、PCR扩增与建库

4．1．2 序列处理

4．1．3 统计分析

4．2 结果

4．2．1 16S rRNA测序结果分析

4．2．2 微生物群落与耐药基因的关联分析

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 猪场及周边地下水环境耐药性风险评估

5．1 材料与方法

5．1．1 取样设计与调查

5．1．2 抗生素检测

5．1．3 DNA提取和荧光定量PCR检测

5．1．4 统计分析

5．2 结果

5．2．1 污水和地下水中抗生素组成与分布情况

5．2．2 污水与地下水中耐药基因的分布情况

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 全文结论

6．1 结论

6．2 主要创新点

6．3 不足之处

6．4 展望及防控措施建议

参考文献

致谢

作者简历