伪狂犬病毒pUL37、VP16、VP22单抗制备及免疫电镜方法的建立

摘要

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主，感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科，具有疱疹病毒粒子的典型结构，其中，被膜层是一个复杂的蛋白网络，位于衣壳和囊膜之间。由UL37、UL48、UL49基因分别编码的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒复制及装配中执行着不同的生物学功能，研究这些蛋白的功能对新的抗病毒靶点筛选具有重要意义。然而，对这些蛋白进行检测和定位的方法还没有建立起来。
　　本研究，首先将UL49、UL48、UL37基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS，并采用KCl染色切胶法纯化原核表达的蛋白。分别用真核质粒和纯化的蛋白作为抗原，对Balb/c小鼠进行3次免疫。通过细胞融合及单抗特性鉴定试验获得1株稳定分泌VP22蛋白单抗的杂交瘤细胞株3D6;2株稳定分泌VP16蛋白单抗的杂交瘤细胞株1D4、4B6;3株稳定分泌pUL37蛋白单抗的杂交瘤细胞株1E2、2G2、11C3。间接免疫荧光(ⅢA)和Western-blot试验表明，抗体株均可与相应蛋白特异性结合;经抗体亚类试剂盒鉴定，单抗亚类均为IgMκ;ELISA检测单抗的效价，1D4为1∶8000，11C3为1∶6000，3D6为1∶3000，4B6为1∶4000，1E2、2G2为1∶32000。
　　测定PRV分离株HLJ-2013的病毒滴度，并将其(0.1MOI)接种于易感性细胞PK15，16h后收集细胞并制备免疫标记用超薄切片。将以上实验获得的单克隆抗体进行1∶50，1∶100，1∶200稀释作为一抗，商品化抗鼠金标抗体1∶100倍稀释作为二抗，进行感染细胞内伪狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫标记和电镜检测。通过对免疫电镜结果的分析，筛选出在亚细胞水平结合特异性强的单克隆抗体株:3D6、1D4、1E2，其最佳稀释比例分别为:1∶100、1∶100、1∶200。
　　综上所述，本研究成功制备出针对PRV被膜蛋白pUL37、VP16、VP22的单克隆抗体，为PRV结构研究提供了生物材料;利用单克隆抗体建立了在PRV感染细胞内pUL37、VP16、VP22蛋白的免疫胶体金标记方法，为这几种蛋白的功能及被膜装配机制的研究提供了技术手段。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 前言

1．1 伪狂犬病病毒

1．1．1 概述

1．1．2 病毒粒子形态学

1．1．3 伪狂犬病毒的基因组结构

1．1．4 伪狂犬病毒的结构蛋白及其功能

1．1．5 疱疹病毒被膜蛋白的研究进展

1．1．6 流行病学

1．2 免疫电镜研究方法

1．3 本研究的目的及意义

第二章 UL49、UL48和UL37基因的克隆及表达

2．1 实验材料

2．1．1 细胞、质粒和毒株

2．1．4 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计及合成

2．2．2 PRV全基因的提取

2．2．3 UL49、UL48和UL37基因的PCR扩增

2．2．4 UL49、UL48和UL37基因真核表达载体的构建

2．2．5 UL48和UL37原核表达载体的构建

2．2．6 VP16和pUL37蛋白的诱导表达

2．2．7 VP16和pUL37蛋白的纯化

2．3 实验结果

2．3．1 UL49、UL48和UL37基因的扩增

2．3．2 真核重组质粒的双酶切鉴定

2．3．3 IFA鉴定真核重组质粒在细胞内的表达

2．3．4 原核重组质粒pET-28a-UL48／UL37的双酶切鉴定

2．3．5 原核蛋白Vp16和pUL37的诱导表达

2．4 讨论

第三章 VP22、VP16、pUL37蛋白单克隆抗体的制备及单抗特性的鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 主要溶液的配制

3．2 实验方法

3．2．1 病毒培养与纯化

3．2．2 间接ELISA方法的建立

3．2．3 小鼠免疫

3．2．4 SP2／0细胞的复苏

3．2．5 饲养层细胞及脾细胞的制备

3．2．6 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆

3．2．7 阳性杂交瘤细胞的冻存

3．2．8 单克隆抗体腹水的制备

3．2．9 间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性

3．2．10 间接ELISA检测抗体效价

3．2．11 VP22、VP16和pUL37单抗的Western-blot鉴定

3．2．12 单克隆抗体亚类的鉴定

3．2．14 染色体计数试验

3．3 实验结果

3．3．1 间接ELISA方法的建立

3．3．2 细胞融合观察

3．3．3 阳性杂交瘤细胞株的筛选

3．3．4 间接ELISA检测杂交瘤细胞的稳定性

3．3．5 单克隆抗体亚类的鉴定

3．3．6 ELISA检测抗体效价

3．3．7 Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性

3．3．8 IFA鉴定单克隆抗体的特异性

3．3．9 杂交瘤细胞染色体数的检测

3．4 讨论

第四章 免疫电镜方法的建立

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．2 免疫条件的优化

4．2．3 免疫样品的制备

4．3 实验结果

4．3．1 PRV HLJ-2013株病毒滴度的测定

4．3．2 细胞病变时间的筛选

4．3．3 一抗的筛选

4．3．4 一抗稀释倍数的优化

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

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