抗大豆孢囊线虫4号生理小种的PI437654突变体的筛选与全基因组测序

摘要

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)是一种严重危害大豆生产的植物病原线虫，在全世界范围内每年给大豆生产造成重大损失。在我国发生与危害大豆的大豆孢囊线虫生理小种主要是1、3及4号生理小种，其中1号和3号生理小种主要分布、发生在东北大豆产区，而4号生理小种主要在黄淮海大豆产区发生与危害大豆。目前，以大豆孢囊线虫3号生理小种侵染大豆鉴定了2个主要的大豆抗孢囊线虫基因rhg1和Rhg4，但大豆抗大豆孢囊线虫4号生理小种基因的研究还未有任何进展。本研究主要以对大豆孢囊线虫表现广谱抗性的PI437654为材料，通过EMS(Ethylmethane Sulfonate，甲基磺酸乙酯)化学诱变开发PI437654大豆突变群体，通过表型鉴定在PI437654突变群体中获得对大豆孢囊线虫4号生理小种侵染表型发生变化的突变体，然后对突变体进行已知抗性基因序列分析，最后，对突变体进行全基因组重测序和序列初步分析以期后续研究最终鉴定出大豆抗大豆孢囊线虫4号生理小种基因。
　　不同EMS处理浓度表明，PI437654的最佳EMS处理浓度为0.75％。与野生型相比，突变体后代表现出很多不同的形态表型，主要表现在叶片、茎节、种子及生育期等方面，比如叶片黄化、白化、皱缩、多叶（叶柄处产生四叶或五叶）、茎节缩短、种子颜色变化及生长期延长等。
　　对PI437654突变体接种大豆孢囊线虫4号生理小种，进行侵染表型鉴定。根据表型鉴定结果，最终从开发的PI437654突变群体随机选取的400个突变体中确认了13个对大豆孢囊线虫4号生理小种的侵染表型发生变化的突变体，表型突变率为3.25％。突变体中雌虫指数最高可达16.9％，而野生型的雌虫指数只有5.8％。同时所有鉴定的突变体仍对大豆孢囊线虫3号生理小种表现高抗性。
　　用突变体的基因组DNA进行了三个已知抗性基因GmSHMT08，GmSNAP18，GmSNAP11的PCR扩增，然后酶切与测序。结果显示上述所有13个鉴定的突变体的三个已知抗性基因的基因组序列没有发生任何变化。说明基因组中其它位点基因发生了突变，从而引起了突变体对大豆孢囊线虫4号生理小种的抗性变化，PI437654中存在新的抗大豆孢囊线虫基因。
　　对部分突变体进行了全基因组重测序，并初步进行了SNPs、InDels等分析，发生在外显子上的SNPs约占4％,主要造成非同义突变;Indels大部分是一个碱基的插入和缺失，主要发生在基因间序列。目前正继续挖掘基因组数据。其结果为最终将鉴定出大豆抗大豆孢囊线虫4号生理小种基因提供理论依据。
　　鉴定抗性基因是揭示大豆抗孢囊线虫分子机制的基础，同时可以为设计准确的分子标记、高通量检测、挖掘抗性资源及分子育种提供理论依据。开发的突变群体则可以作为新的大豆遗传种质资源库，为相关性状的研究提供遗传材料。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 大豆孢囊线虫

1．1．1 大豆孢囊线虫的分类学地位

1．1．2 大豆孢囊线虫的发生及分布

1．1．3 大豆孢囊线虫生活史

1．1．4 大豆孢囊线虫的传播和危害

1．2 大豆抗大豆孢囊线虫基因研究进展

1．2．1 已鉴定的大豆抗孢囊线虫基因

1．2．2 大豆抗孢囊线虫基因作用的分子机制

1．2．3 其它大豆抗大豆孢囊线虫QTL

1．3 EMS诱变与测序技术在作物研究中的应用

1．3．1 EMS诱变突变群体在作物育种及性状基因鉴定中的应用

1．3．2 下一代测序技术在作物育种及性状基因鉴定中的应用

1．4 本研究的目的和意义

第二章 化学诱变大豆突变群体的开发与田间表型观察

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 EMS处理大豆种子方法

2．1．4 突变体种植及突变群体的开发

2．1．5 突变体形态表型调查

2．2 结果与分析

2．2．1 EMS处理大豆的最佳浓度

2．2．2 PI437654突变群体的开发

2．2．3 主要突变体形态表型

2．3 小结与讨论

第三章 大豆孢囊线虫4号生理小种对PI437654突变体侵染表型的鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 大豆温室种植

3．1．3 大豆孢囊线虫卵的收集与接种

3．1．4 大豆根组织内线虫染色观察

3．1．5 大豆孢囊线虫侵染表型调查

3．2 结果与分析

3．2．1 大豆孢囊线虫4号生理小种对大豆根的侵染

3．2．2 大豆孢囊线虫4号生理小种侵染表型变化的PI437654突变体初步筛选

3．2．3 PI437654突变体的表型验证

3．2．4 PI437654突变体对大豆孢囊线虫3号生理小种的抗性

3．3 小结与讨论

第四章 PI437654突变体中已知大豆孢囊线虫抗性基因序列分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 突变体基因组DNA的提取

4．1．4 突变体的已知大豆孢囊线虫抗性基因分析

4．2 结果与分析

4．2．1 突变体已知抗性基因的酶切分析

4．2．2 突变体的已知抗性基因序列分析

4．3 小结与讨论

第五章 突变体全基因组重测序及数据初步分析

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验流程

5．2 结果与分析

5．2．1 SNPs初步分析

5．2．2 InDels初步分析

5．3 小结与讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历