玉米乙酰乳酸合成酶基因单碱基编辑创制氯磺隆除草剂抗性种质

摘要

农田杂草与作物竞争生长空间、光照、水、土壤、养分等资源，形成草害，导致作物减产并造成严重经济损失。随着杀草谱广、活性高、除草效果好且对环境友好的除草剂被不断成功研发应用，除草剂使用面积不断扩大，已成为农田杂草治理主要方式。但是，除草剂导致农作物药害事故频发，成为农业生产亟待解决的重要问题之一。通过常规与生物技术方法培育除草剂抗性作物品种为该问题的解决提供了有效途径。常规除草剂抗性育种受限于难以筛选与发现稀有的突变。转基因生物技术则需要复杂且时间和经济成本高昂的环境与生物安全审批流程以及跨国公司对该领域专利的技术垄断。因此，通过基因编辑技术定点突变玉米等作物的内源基因培育抗性品种，具有重大的产业应用前景与价值。本研究以玉米（Zea mays L.）乙酰乳酸合成酶基因（ZmALS1和ZmALS2）为靶基因，构建了胞嘧啶单碱基编辑工具，通过精确单碱基编辑的方式将玉米ZmALS1和ZmALS2中第165位脯氨酸替换为丝氨酸，在不影响支链氨基酸合成代谢活性的情况下，降低其对氯磺隆除草剂的敏感性，创制氯磺隆除草剂抗性玉米种质。主要结果如下: 1、以残基肽XTEN为衔接物将大鼠胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)融合至Cas9(D10A)的N末端。将抑制碱基切除修复的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)和一段核定位信号(NLS)融合至Cas9(D10A)的C末端。再将该APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)-UGI融合序列插入基础载体CUB中，构建成胞嘧啶单碱基编辑载体。以玉米UBI启动子驱动Cas9(D10A)，以RNA聚合酶Ⅲ类启动子ZmU6-2驱动sgRNA，靶向编辑ZmALS1和ZmALS2，最终构建成ALS-CBE载体。 2、以玉米自交系ZC01幼胚为转化受体，通过农杆菌介导的稳定遗传转化法转化。以实时荧光定量扩增bar基因的检测法获得38个独立的T0阳性转化体。T0阳性转化体自交或测交得T1代。以转基因bar快速检测试纸检测法获得550株T1代转基因阳性植株。 3、测序验证T1代转基因阳性植株的靶基因。测序结果显示:发生目标C7-T7替换突变的有13株，C7-G7、C7C8-T7T8、C7C8-T7G8各1株。这16个T1代株系来源于T0代的3个株系。总突变率为8.0％。T1代阳性植株自交获得T2代，T2代植株检测中也分别检测到了以上突变，说明目标突变可稳定遗传至后代。 4、通过浓度梯度筛选确定氯磺隆除草剂对苗期玉米的有效作用浓度为100mg/L。以该浓度除草剂喷施苗期玉米植株:除草剂喷施的野生型植株全部枯萎死亡，而目标突变植株生长正常，表现出对氯磺隆除草剂的耐性。对靶标突变玉米的百粒重、株高、穗位高以及叶片数等重要生物性状进行了测定。与野生型植株相比各项测定结果均没有显著差异。 5、针对所设计的sgRNA进行在线脱靶预测。搜索到排名前五的潜在脱靶位点，对潜在脱靶位点测序验证，测序结果显示没有任何突变。这与最新的关于CBE系统会引发全基因组突变，而不能通过计算机预测到脱靶位点的研究结论是一致的。但是，在玉米全基因组中CBE系统是否真正造成脱靶以及脱靶突变发生的类型和区域还在进一步研究中。