沙门氏菌E3泛素连接酶SspH2和SlrP调控Ⅰ型IFN信号通路的研究

摘要

沙门氏菌能够通过Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion systems，T3SS)分泌细菌蛋白（效应蛋白）到宿主细胞里，从而调控宿主一系列生理功能。沙门氏菌有两种不同的T3SS，分别为由毒力岛（Salmonella pathogenicity islands，SPI）-1编码的T3SS-1和由SPI-2编码的T3SS-2。泛素化作为蛋白翻译后的一种修饰方式，在抵抗细菌感染时发挥重要作用，然而细菌也能够利用T3SS分泌系统，通过各种泛素途径对宿主进行瞬时和空间调控。有文献报道，细菌可以通过含有LRR结构域的E3泛素连接酶调控宿主的天然免疫反应。如福氏志贺菌IpaH9.8通过泛素化降解NEMO，从而抑制NF-κB信号通路的激活;IpaH4.5通过泛素化降解TBK1，从而抑制IRF3的磷酸化、入核及IFN的产生。沙门氏菌E3泛素连接酶SspH2和SlrP也具有LRR结构域，然而目前并没有研究报道SspH2和SlrP在IFN信号通路中的作用。 为研究沙门氏菌E3泛素连接酶SspH2和SlrP在IFN信号通路中的作用，本研究首先筛选到一株能正常编码并表达SspH2和SlrP蛋白的沙门氏菌CVCC542，然后构建并表达SspH2(10-210aa)和SlrP(1-200aa)蛋白，免疫小鼠后，获得抗SspH2和SlrP的多克隆抗体;为了从菌株水平上验证SspH2和SlrP的功能，本研究成功构建了ssph2和slrP基因缺失株，且ssph2或slrP基因缺失不影响沙门氏菌的生长;为了验证SspH2或SlrP参与调控Ⅰ型IFN信号通路，本研究通过梯度过表达SspH2或SlrP检测对IFN-β或ISRE启动子活性的影响，结果表明只有SspH2抑制IFN-β和ISRE启动子活性;随后本研究证明SspH2与干扰素调控因子IRF3相互作用，并且体外泛素化实验证明SspH2能够增强IRF3的泛素化;野生型沙门氏菌和ssph2基因缺失株分别感染细胞，结果显示野生型沙门氏菌感染细胞中的IRF3的蛋白表达量明显低于ssph2基因缺失株感染细胞中的IRF3的蛋白表达量，结果表明SspH2通过影响IRF3的表达从而发挥抑制Ⅰ型IFN的作用。 综上，本研究通过全基因组测序、多抗制备、缺失菌株构建及其生长曲线测定、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀、细菌侵染细胞等多项技术证明SspH2在IFN信号通路中发挥抑制作用，且其作用机制是通过与IRF3相互作用增加IRF3的泛素化并影响IRF3的表达从而抑制Ⅰ型IFN的产生，而SlrP蛋白对IFN信号通路无影响，本研究为阐明沙门氏菌调控天然免疫分子机制奠定基础，为细菌逃逸宿主天然免疫反应提供新的数据支持，有利于寻找新的药物靶点。