棉花耐旱QTL定位及6个耐旱/盐基因家族的鉴定和功能研究

摘要

本研究采用一个棉花种间杂种BC2F2的回交自交系群体，进行干旱胁迫处理以及基因型测序(GBS)和分型，定位了耐早的数量性状位点(QTLs)。在稳定的QTL区域内进一步挖掘基因，在干旱条件下评价基因的功能。参考陆地棉[(AD)1]、亚洲棉(A2)和雷蒙德氏棉(D5)基因组测序数据，对NLP、LEA、TH、CDK、CYP450和Alba等基因家族进行了全基因组鉴定分析;对各个基因家族中的部分新基因进行了克隆，转化到拟南芥或陆地棉中进行了干旱和盐胁迫或缺氮条件下性状鉴定，通过正向和反向遗传学手段分析了它们的功能。 1.BC2F2群体的耐早QTL定位 采用自陆地棉和毛棉种间杂交的BC2F2群体的188个系，构建了一个含有10888个SNP标记的遗传图谱。图谱全长4191.3cM，平均标记距离0.1047cM，覆盖At和Dt两个亚基因组各约51％和49％。该图谱包括30个稳定的耐旱QTLs，其中有3个成簇分布（簇1、4和10），在每条染色体含有1个位点以上的簇被认为是主要的QTL簇。QTLs位点在At亚基因组略多（17个）在Dt亚基因组较少（13个）。在图谱中与耐旱生理性状相关的GBS标记紧密区域挖掘到89个基因，其大多数有内含子，只有17％（15个）基因无内含子。这些基因参与所有GO的三种功能注释。RNA测序分析，发现了与非生物胁迫相关的miRNA，如已知与NAC、MYB基因相关的miR164，在提高植物耐早性方面具有重要作用。通过RT-qPCR发现了参与增强棉花耐旱性的关键基因5个。 2.六个基因家族的全基因组鉴定 以全基因组测序的3个棉种陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉分别代表棉属的AD、A和D三个基因组，用其全基因组数据鉴定了以下6个基因家族:(1)LEA基因，数量分别为242、136和142，被分为8个亚家族。AD基因组中LEA基因内含子较少，并分布于所有染色体。大多数复制的LEA基因是片段性的。共线性分析表明，较高比例的LEA基因是保守的。片段复制在棉花LEA基因的扩增中起关键作用。8个亚家族中LEA2最为丰富，具有疏水性，并进一步分为6个亚组，分别为亚组1～6。系统发育树分析揭示了棉花基因组内LEA基因家族的直系同源基因是成对的。(2)CDK，数量分别为31、15和12，分布于AD、D和A基因组的15、10和9个连锁群上。所有CDK基因被分为6个亚家族。(3)三螺旋转录因子(TH)，在AD、A和D基因组中数量分别为102、51和51。(4)CYP450，在AD、A和D基因组中分别有672、374和379个。在四倍体棉花(AD)中，CYPs基因分布在所有26条染色体上，但主要集中在Ah05和Ah12，以及它们在A和D基因组中的同源染色体。(5)Alba，在AD、A和D基因组中数量分别为33、17和20，编码的蛋白质长度范围由62aa至312aa，分子量(MW)范围为7.003kDa至34.55kDa，总平均亲水性(GRAVY)值为-1.012至0.609，等电点(pI)值为-3至11。(6)NLP，分别有105、61、60个位于AD、A和D基因组，编码蛋白长度由63aa至1，403aa，MW为7kDa至152kDa，pI为4至10，GRAVY值范围为-1至0，具有亲水性。 3.LEA和Alba基因家族的Cis调控元件、miRNA预测和GO分析 发现63个miRNA靶向89个基因，如miR164、ghr-miR394等。GO分析表明，LEA基因参与干旱和防御反应。发现类似的miRNA靶向其它基因家族成员，例如Alba基因，gra-miR8770靶向4个基因，gra-miR8752和gra-miR8666靶向3个基因，gra-miR8657a、b、c、d、e各靶向10个基因，而其余则靶向1至2个基因。此外，几乎所有LEA基因的启动子区域都含有ABRE、MBS、W-Box和TAC-elements，已知它们功能上参与干旱和其它胁迫响应。在其它功能基因家族中观察到同样现象。最后，GO揭示了所有三个基因注释，分子功能、生物学过程和细胞组分，表明这些基因家族编码的蛋白在增强植物非生物胁迫耐受性方面发挥不可或缺的作用。 4.RNA和RT-qPCR验证不同基因家族编码的蛋白 表达谱分析表明，多数LEA、LEA2、CDK、TH、CYP450和NLP基因在干旱和/或盐胁迫条件下有高表达。此外，与干旱敏感性品种陆地棉相比，LEA基因在野生种毛棉中的表达水平较高。干旱胁迫下，耐旱性基因型比陆地棉品种具有更强的基因调控能力。这一发现为旱作条件下陆地棉LEA基因及其在植物中可能的功能提供了全面分析的信息基础。在各基因中，有部分基因特异的高度上调，Cot_AD24498(LEA2)、Gh_D12G2017(CDK)、Gh_A05G2067(TH)，CYP450和Alba各有两个基因，Gh_D07G1197和Gh_A13G2057(CYP450)，以及Gh_D01G0884和Gh_D01G0922(Alba)。这些基因在拟南芥和棉花中分别通过正向和反向遗传得到进一步的功能鉴定。 5.干旱/盐胁迫下五个基因家族的功能鉴定 转化基因Cot_AD24498(LEA2)、Gh_D12G2017(CDKF4)和Gh_A05G2067(GT-2)在拟南芥中的过表达，揭示了它们在提高植物非生物胁迫耐受性方面的意义。LEA2基因的过表达表明，参与了促进根系生长，进而具有耐旱性。Gh_D12G2017(CDKF4)、Cot_AD24498(LEA2)和Gh_A05G2067(GT-2)拟南芥过表达系在干旱和盐胁迫条件下表现出较高的抗氧化酶浓度，包括过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)浓度，且氧化剂水平极低。此外，细胞膜稳定性(CMS)、离体叶片水分损失(ELWL)、饱和叶重(SLW)和叶绿素含量的测定表明，转基因拟南芥对这两种胁迫因子的耐受性均高于野生型(WT)。同样，胁迫响应基因RD29A、SOS1、ABF4和CBL1在过表达系中高度上调，在野生型中显著下调。由于高水平的氧化酶，TH、CYP450、Alba和NLP沉默棉株表现出高水平的氧化损伤，且对CMS、ELWL、RLWC和叶绿素含量有负面影响。此外，所有胁迫响应基因在野生型中均呈上调趋势，而在VIGS植株中显著下调。