利用侵染性cDNA研究甜菜坏死黄脉病毒RNA5与病毒致病性的关系

摘要

利用RT-PCR对来自新疆、黑龙江、宁夏、甘肃、河北省甜菜丛根病病田的各BNYVV分离物中RNA5组分进行检测,在来自于新疆、宁夏和黑龙江的分离物中发现有RNA5的存在,说明在中国发生的BNYVV分离物中广泛存在RNA5组分.对新疆、宁夏和黑龙江分离物中的RNA5进行克隆和序列分析后,与已报道的BNYVV日本D5分离物、法国的F72分离物以及中国内蒙古发现的包头分离物和呼和浩特分离物的RNA5的核苷酸序列和推导氨基酸序列进行同源性比较.结果表明,不同分离物RNA5核苷酸序列的同源性为93.0％~98.7％,变异主要集中在编码蛋白启始密码子AUG前100个核苷酸的区域内.所有RNA5基因组都只包含一个开放阅读框架(ORF),除法国的F72(编码232个氨基酸)外,其它6个分离物都编码228个氨基酸的多肽.各分离的氨基酸序列同源性为89.7％~98.7％.构建了RNA5编码蛋白的原核表达载体pETHu26,经IPTG诱导后在大肠杆菌中得到表达,表达的融合蛋白包含载体编码的45个氨基酸和RNA5编码的26kDa蛋白.用融合蛋白免疫家兔,制备了RNA5编码蛋白的特异性抗血清,Western blot分析表明该血清可以用于BNYVV接种番杏叶片后RNA5编码26kDa蛋白的检测.分别构建了T7启动子和35S启动子控制下的全长RNA5侵染性cDNA克隆,Northern blot检测表明它们都具有侵染性.利用T7控制下的全长RNA5侵染性cDNA克隆pUCHu3的体外转录物与不含RNA5的BNYVV突变株,BNYVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs混合接种番杏和甜菜,结果表明RNA5影响病毒侵染后寄主的症状表达和病毒在寄主内的积累,并且和甜菜丛根病的发病程度及甜菜产量有关.这些结果表明除了RNA3外,RNA5是另外一个与BNYVV致病性相关的因素.在全长RNA5侵染性克隆pUCHu3的基础上构建了4个RNA5编码区缺失突变体和1个点突变体的侵染性克隆.经体外转录后与BNYVV-Hu3的RNAs混合接种番杏,Northern blot检测表明这些突变体的体外转录物都具有侵染性.用编码区翻译起始密码(AUG)突变体侵染性克隆pUCHu3△ATG体外转录物接种番杏叶片,经过发病植物的检测,说明RNA5编码蛋白的表达与否不影响BNYVV在番杏上的症状表现,即RNA5对于BNYVV致病力的影响可能是在核酸水平上的作用.这些突变体对RNA5的功能的影响正在进一步研究中.

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文摘

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独创性声明及关于论文使用授权的说明

缩略词

第一章文献综述

二、植物RNA病毒侵染性cDNA克隆的构建及其应用

三、本课题研究的目的和意义

第二章材料与方法

一、实验材料

二、常用培养基和溶液的配制

三、实验方法

第三章BNYVV RNA5的检测、克隆和序列分析

1.不同BNYVV分离物RNA5的检测和克隆

2.重组质粒克隆片段的序列分析

3.讨论

第四章BNYVV RNA5编码蛋白在大肠杆菌中的表达

1.RNA5编码蛋白原核表达载体的构建

2.融合蛋白在大肠杆菌中的表达

3.RNA5编码蛋白抗血清的制备及Western blot检测

4.讨论

第五章BNYVV RNA5对病毒致病性的影响

1.T7启动子控制下的RNA5侵染性cDNA克隆的构建

2.RNA5对病毒致病性的影响

3.35S启动子控制下的BNYVV RNA5 cDNA侵染性克隆的构建与检测

4.RNA5编码区突变体侵染性克隆的构建及其生物活性的检测

5.讨论

工作总结和研究展望

参考文献

致谢

作者简历