利用转基因体细胞核移植生产转基因绵羊相关技术研究

摘要

该文系统地研究了利用体细胞克隆技术来生产转基因绵羊的几个主要技术环节,以便建立转基因和核移植操作程序,主要内容包括转基因细胞系的建立、激活、融合参数的优化以及供体核和受体细胞质对核移植胚胎发育的影响.首先从3个30日龄绵羊胎儿分离出成纤维细胞,经过体外培养,建立了SFF1、SFF2和SFF3细胞系.胎儿成纤维细胞有生长快、数量多、传代多等特点.染色体倍性检测表明,前20代没有明显变化,染色体倍性正常率均在70％以上.选用报告基因GFP转染胎儿成纤维细胞,优化电穿孔法和磷酸钙沉淀法的转染条件.电穿孔法最佳转染条件为:采用场强1.25kV/cm,脉冲时程15ms,电导介质为Dhanks,DNA用量为4μg/ml,对数期细胞密度为10<'6>-10<'7>个/ml,电击后在4℃下分别静放10min,能获得最佳转染效果.磷酸钙沉淀法最佳转染条件为:2HBS溶液最佳的PH为6.9-7.1,在37℃下,加入6.4μg/ml DNA,甘油休克7分钟,转染24小时,克隆株数最多,效果最佳.采用电穿孔法成功地敲除Myostatin,以转染时的细胞数来计算转染率约为10<'-6>,形成纯合子概率约为1.5×10<'-8>.在孤雌激活方面,采用电脉冲时程为80μs,场强为1.2kv/cm能有效激活卵母细胞;在5.0μM离子霉素内处理5分钟,能获得最佳的激活效果,激活率为90.9％;在7％乙醇内处理7分钟可达到最大激活率91.8％.实验发现,离子霉素和电脉冲对绵羊卵母细胞激活较乙醇更为有效.为了探索核移植技术中电融合参数,对绵羊2-细胞胚胎的融合进行了研究,在脉冲里程40μs-150μs,场强为2.2kv/cm下,能有效地融合绵羊2-细胞胚胎细胞,可获得70.4％-77.1％融合率.为了克服绵羊8-16细胞胚胎发育的阻断,采用KSOM作为发育液效果好于SOF;在不同阶段使用含有不同蛋白质的发育液,超过16-细胞的胚胎百分率为46.1％,高于单独使用一种蛋白质,它们差异显著(p<0.05);添加10ng/mlEGF和50μmol/mL牛磺酸能显著提高超过16细胞胚胎发育率,可达62.6％.受体卵母细胞和供体核的准备是核移植成功的关键.在受体方面,卵龄为18-20小时,去核率最高,可达71.6％;用经产母羊卵母细胞为受体好于用育成羊卵母细胞为受体细胞,前者的重构胚囊胚率为15.7％,后者重构胚囊胚率为2.9％,二者差异显著(P<0.05);季节对核移植的影响也是不容忽视的,繁殖季节重构胚囊胚发育率(13.8％)明显高于非繁殖季节重构胚囊胚发育率(4.7％),二者差异显著(P<0.05).在供体方面,用5-7代细胞作供体核,桑椹/囊胚率高于16-18代的桑椹/囊胚率,二者差异显著(P<0.05);直径为20-25μm细胞作供体核,桑椹/囊胚率可达20.0％,而直径为10-15μm细胞作供核,桑椹/囊胚率可达8.0％,但二者差异不显著(P>0.05);血清饥饿与非血清饥饿的细胞做供体核,桑椹胚/囊胚发育率没有显著差异;用0.05μM秋水仙素处理供体细胞效果最好,桑椹/囊胚率可达35.0％,而未处理或用0.1μM秋水仙素处理供体细胞,桑椹/囊胚率分别为17.1％和12.1％,它们与0.05μM处理差异显著(P<0.05),可见,0.05μM秋水仙素是最佳处理浓度;以GFP转基因细胞系作为供体,获得81个重构胚,没有得到囊胚.综上所述,我们基本上建立了生产转基因克隆胚胎的实验操作程序,获得了各个环节的技术参数,但效率低下,重构胚发育能力弱,仍需进一步大量的研究.

目录

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摘要

ABSTRACT

略语表

第一部分体细胞核移植实践与理论的分析(综述)

一、哺乳动物体细胞克隆研究进展

二、体细胞核移植的理论分析

三、哺乳动物体细胞克隆存在的问题及其思考

四、体细胞克隆技术的展望

五、结束语

第二部分实验部分

第一章绵羊转基因细胞系的建立

实验一绵羊胎儿成纤维细胞体外培养发育动力学特性研究

实验二磷酸钙沉淀法将GFP基因导入绵羊胎儿成纤维细胞研究

实验三电穿孔法制备转GFP基因绵羊胎儿成纤维细胞的研究

实验四绵羊Myostatin基因敲除

第二章孤雌激活、卵裂球的融合及其发育的研究

实验一几种方法激活绵羊体外成熟卵母细胞及其比较

实验二孤雌激活的绵羊2-细胞胚胎电融合的研究

实验三克服绵羊8-16细胞胚胎发育阻滞的发育液研究

第三章核移植技术平台的建立

实验一 受体卵母细胞对核移植胚胎的影响

实验二 供体细胞核对核移植胚胎发育的影响

第三部分结论

参考文献

致谢