拟南芥保卫细胞微丝骨架参与细胞外钙调素调控气孔运动的研究

摘要

已有的研究表明细胞外钙调素(CaM)存在于蚕豆保卫细胞质膜外侧并能促进气孔关闭,抑制气孔开放.而微丝骨架参与了多种细胞外信号调控的气孔运动,但还不清楚是否参与以及如何参与细胞外CaM在保卫细胞的信号转导.该研究在表皮条生物学分析的基础上,主要利用激光共聚焦显微技术,转基因技术研究了微丝骨架在细胞外CaM调控气孔运动中的作用.免疫印迹和免疫荧光定位结果表明拟南芥的保卫细胞壁存在CaM;外源CaM能够促进拟南芥气孔关闭并抑制光照诱导的气孔开放;不过膜的大分子CaM的拮抗剂W7-agarose和CaM抗血清在无外源CaM的情况下,均能抑制气孔的正常关闭,促进气孔的正常开放,说明内源细胞外CaM和外源CaM一样,也是气孔运动的一个调节因子.以表达GFP-mTn融合蛋白的转基因拟南芥为材料,利用激光共聚焦扫描技术研究了细胞外CaM对保卫细胞微丝骨架动态变化的调控作用.结果表明细胞外CaM能诱导保卫细胞微丝骨架的解聚,这种解聚作用是时间依赖的;而微丝骨架的拮抗剂细胞松驰素.D(CD)和稳定剂鬼笔环肽(Phalloidin)分别能促进和抑制细胞外CaM诱导的气孔关闭.因此推测微丝骨架的解聚参与了细胞外CaM诱导的气孔关闭,并是细胞外CaM诱导气孔关闭所必需的.细胞外CaM能诱导保卫细胞[Ca<'2+>]<,cyt>升高.当[Ca<'2+>]<,cyt>升高被抑制后,细胞外CaM不能诱导微丝骨架解聚和气孔关闭.这个结果表明细胞外CaM可能通过诱导保卫细胞[Ca<'2+>]<,cyt>升高,来促进微丝骨架的解聚,进而导致气孔关闭.利用RT-PCR的方法克隆了拟南芥微丝解聚因子AtADF2 cDNA的全长,经过原核表达得到了AtADF2的融合蛋白并制备了其抗体.Western实验证实AtADF2在各个营养组织中都有表达,其中叶片中含量最高.免疫荧光定位结果表明ADF2存在于保卫细胞中.利用转基因技术得到了ADF2的正义和反义表达的转基因植株.ADF2的过量表达促进了细胞外CaM诱导的气孔关闭,而抑制ADF2的表达则有相反的结果,但CD的处理能消除这种抑制作用.这些结果暗示植物体内ADF2的过量表达能够促进保卫细胞微丝骨架的解聚,从而促进了气孔对细胞外CaM的反应.利用转基因技术获得了保卫细胞中AtPROFILIN1大量表达的阳性植株,生物学分析表明AtPROFILIN1的过量表达促进了细胞外CaM诱导的气孔关闭,CD不能促进转基因植株气孔对细胞外CaM的反应,而Phalloidin却能抑制这一过程.荧光标记保卫细胞中的微丝骨架,结果表明AtPROFILIN1的过量表达使得保卫细胞中的微丝骨架解聚.这些结果表明PROFILIN1的过量表达促进了保卫细胞微丝骨架,从而促进了气孔对细胞外CaM的反应.AtPROFILIN1和AtADF2的过量表达也促进气孔对光照,黑暗和ABA的反应,说明在复杂的保卫细胞信号转导中,多种细胞外信号的转导是相互交错的.在该文研究中,我们发现细胞外CaM是通过诱导保卫细胞微丝骨架的解聚来促进气孔关闭的,转基因植株的实验结果进一步证实了这一发现.CaM可能是通过诱导保卫细胞[Ca<'2+>]<,cyt>升高,激活PROFILIN1,促进F-actin的解聚,或者CaM通过激活保卫细胞中的ADF2,促进F-actin解聚.

目录

文摘

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缩写词

第一章文献综述

1.1微丝骨架在植物生理活动中的功能

1.2植物中的微丝结合蛋白PROFILIN(前纤维蛋白)

1.3植物中的微丝结合蛋白ADF/COFILIN(微丝解聚因子)

1.4保卫细胞中的微丝骨架

1.5细胞外CaM参与植物生理活动的研究进展

第二章拟南芥保卫细胞微丝骨架的解聚参与了细胞外钙调素诱导的气孔运动

前言

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.2.1 CaM在保卫细胞壁的存在

2.2.2细胞外CaM对气孔运动的影响

2.2.3细胞外CaM对微丝骨架的影响

2.2.4Phalloidin和CD对细胞外CaM诱导气孔关闭的影响

2.2.5[Ca2+]cyt2+对细胞外CaM诱导保卫细胞微丝骨架解聚的影响

2.3讨论

第三章拟南芥ADF2 cDNA克隆、原核表达及抗体制备

前言

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.3.1拟南芥ADF2 cDNA克隆与鉴定

3.3.2原核表达载体pGEX-ADF2的构建与鉴定

3.3.3 pGEX-ADF2融合蛋白的诱导表达、纯化与鉴定

3.3.4抗血清制备与效价的测定

3.4讨论

第四章过量和抑制表达AtADF2对细胞外CaM诱导气孔运动的影响

前言

4.1材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.3.1真核表达载体pBI-ADF2的构建与鉴定

4.3.2农杆菌介导的拟南芥转化

4.3.3转基因植株的鉴定

4.3.4AtADF2在保卫细胞的存在

4.3.5改变AtADF2的表达水平对光照诱导气孔开放的影响

4.3.6改变AtADF2的表达水平对黑暗诱导的气孔关闭的影响

4.3.7改变AtADF2的表达水平对ABA诱导的气孔关闭的影响

4.3.8改变AtADF2的表达水平对细胞外CaM诱导气孔关闭的影响

4.3.9 CD和Phalloidin对转基因植株气孔运动的影响

4.4讨论

第五章过量表达AtPROFILIN1对细胞外CaM诱导气孔运动的影响

前言

5.1方法

5.2结果与分析

5.2.1农杆菌介导的拟南芥转化

5.2.2转基因植株的分子水平鉴定分析

5.2.3 AtPROFILIN1的过量表达对ABA诱导气孔关闭的的影响

5.2.4 AtPROFILIN1的过量表达对光照诱导气孔开放的影响

5.2.5 AtPROFILIN1的过量表达对细胞外CaM诱导气孔关闭的影响

5.2.6 细胞松驰素和鬼等环肽对细胞外CaM诱导的转基因植株气孔关闭的影响

5.2.7 AtPROFILIN1的过量表达对保卫细胞微丝骨架的影响

5.3讨论

结论

参考文献

致谢

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