飞蝗气味分子结合蛋白的分离纯化原核表达及生化特征

摘要

该文采用生物化学方法及分子生物学方法研究了飞蝗Locusta migratoria的气味分子结合蛋白(odarant-binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)的生化特性和基因的克隆及表达.利用荧光技术分析了飞蝗中这两类蛋白及沙漠蝗Schistocerca gregaria重组CSP(recCSPsg4)的结合特性,初步探讨了OBPs和CSPs的生理功能.主要结果如下:1.飞蝗中OBP:电泳分析发现飞蝗雌雄两性触角中特异性存在着一类蛋白,其N-端测序及克隆测序表明它属于气味分子结合蛋白.克隆测序获得飞蝗中的两条OBP序列(LmigOBP,GenBank登录号为AF542076),但二者间仅在第19位氨基酸不同,分子量为14.8kDa,等电点为4.7.氨基酸序列中的6个保守半胱氨酸间以二硫键相互连接.根据已知BombyxmoriPBP的结构,模拟得到飞蝗OBP的三维模型,主要由a-螺旋构成.构建LmigOBP的原核表达载体(pET-LmigOBP)并在大肠杆菌(E. coli)中表达.重组蛋白(recLmigOBP)表达量很高,主要以包涵体形式存在.二硫键被破坏后蛋白可溶性增大,经过离子交换和凝胶过滤,得到高纯度的recLmigOBP.无论天然蛋白还是重组蛋白,都以二聚体的形式存在.这是飞蝗乃至整个直翅目中首次关于OBP序列及相关特性的研究报道.2.飞蝗中CSP:对飞蝗触角cDNA文库进行筛选,克隆测序得到15条新的CSP序列(CSPlm,GenBank登录号为AY149648~AY149662),所得CSP新序列中都具有以二硫键顺次连接的4个保守的半胱氨酸.根据CSPs氨基酸序列间相似性将其分为两个亚类CSPlm-Ⅰ和CSPlm-Ⅱ,其分子量在12.2~12.9kDa间,等电点为5.1~6.2.构建其中一个CSP(CSPlm-Ⅱ-10)的表达载体(pET-CSPlm-Ⅱ-10)并在大肠杆菌中高效表达.经过凝胶过滤和离子交换,得到纯化的重组CSP(recCSPlm-Ⅱ-10).同时从飞蝗触角和翅中分离鉴定出6条CSP序列,用MALDI-MS技术测定的分子量与克隆测序所得15条蛋白序列的分子量相比较,二者之间相似性低.在飞蝗翅中含有高浓度的CSP,对其进行分离纯化.且发现在飞蝗翅中活体中与CSPs结合在一起的物质为油酸酰氨.3.OBP和CSPs在飞蝗过程中地时空表达:同时也监测了飞蝗LmigOBP,CSPlm-Ⅰ和CSPlm-Ⅱ分别在飞蝗的不同生物型(散居型和群居型)、体躯的不同部位、不同生长发育期(蝗蝻和成虫期)的表达.结果表明OBP仅特异地存在于触角中,而CSPs较为普遍的存在于蝗虫躯体不同部位,且不同的CSP亚类表达部位也有所不同.4.沙漠蝗中CSP的结合特性:根据荧光结合学说,测定recLmigOBP,recCSPlm-Ⅱ-10及recCSP-sg4与N-苯基萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)的结合特性,蛋白解离浓度分别为1.7μM,6.2μM和4.0μM.根据目前实验结果发现1-NPN为CSP及OBP最强的荧光结合配基.因此在竞争结合实验中,可用1-NPN作为荧光探针来衡量其它配基的竞争结合能力.结果表明2-戊基肉桂醛(2-amylcinnamaldehyde)为竞争结合能力最强的配基之一.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明和关于论文使用授权的说明

英文缩略词简表

前 言

第一章文献综述

1.1昆虫感受外界化学信号的机理

1.1.1昆虫的信息化合物

1.1.2化学感受器

1.1.3信号传导途径

1.2化学感受中的结合蛋白

1.2.1昆虫的气味分子结合蛋白

1.2.2化学感受蛋白

1.2.3昆虫OBP和CSP的进化

1.2.4 OBPs和CSPs的生理功能

1.2.5 OBPs或CSPs缺失昆虫的行为

1.3技术路线

第二章飞蝗Locusta migratoria中的气味分子结合蛋白

2.1材料与方法

2.1.1试验材料与仪器

2.1.2 LmigBP1的分离纯化

2.1.3 RNA提取和cDNA的合成

2.1.4聚合酶链式反应

2.1.5克隆及测序

2.1.6 LmigOBP1-B在表达载体中的克隆

2.1.7重组蛋白LmigOBP1-B的表达

2.1.8分子量特性

2.1.9酶消化

2.1.10质谱

2.1.11结合实验

2.1.13蛋白热稳定性测定

2.1.14分子模型

2.2结果

2.2.1蝗虫中LmigOBP1的分离鉴定

2.2.2克隆测序

2.2.3原核表达及重组蛋白的纯化

2.2.4重组及天然状态LmigOBP1的二硫键

2.2.5荧光结合实验

2.2.6蛋白热稳定性测定

2.2.7分子模型

2.3讨论

第三章飞蝗Locusta migratoria中的化学感受蛋白

3.1材料与方法

3.1.1试验材料与仪器

3.1.2 CSPs的分离纯化

3.1.3内源性配基的提取

3.1.4 RNA提取和cDNA的合成

3.1.5聚合酶链式反应

3.1.6克隆及测序

3.1.7 CSPlm-Ⅱ-10在表达载体中的克隆

3.1.8重组CSPlm-Ⅱ-10的表达

3.1.9分子量特性

3.1.10荧光检测

3.1.11结合实验

3.2结果

3.2.1飞蝗触角中CSPs分离与鉴定

3.2.2飞蝗CSPs蛋白的内源性配基

3.2.3飞蝗中CSPs序列的克隆

3.2.4 CSP的原核表达

3.2.5结合实验

3.2.6序列登录号

3.3讨论

第四章飞蝗发育过程中气味分子结合蛋白和化学感受蛋白的时空表达

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2抗体的制备

4.1.3 Western-Blot分析

4.2结果

4.2.1飞蝗不同器官中OBP和CSPⅠ，CSPⅡ的表达及其免疫印迹

4.2.2 OBP及CSPⅠ，CSPⅡ在飞蝗不同发育时期的表达及其免疫印迹

4.3讨论

第五章沙漠蝗化学感受蛋白的结合特性

5.1材料和方法

5.1.1试验材料及仪器

5.1.2配基的合成

5.1.3荧光检测

5.1.4蛋白本身所发荧光特性的测定

5.1.5蛋白热稳定性测定

5.1.6不同配基与recCSP-sg4结合特性研究

5.1.7其它配基的竞争结合特性研究

5.1.8数据分析

5.2结果

5.2.1蛋白本身所发荧光特性的测定

5.2.2蛋白热稳定性测定

5.2.3不同配基与recCSP-sg4结合特性研究

5.2.4其它配基的竞争结合特性研究

5.3讨论

第六章讨论

6.1 OBPs及CSPs的氨基酸序列多样性

6.2 OBPs和CSPs的类型与功能

6.3 OBPs及CSPs进化

6.4 OBPs及CSPs与昆虫化学信号的传导、接受和编码的相互关系

参考文献

致 谢

作者简历