蚕豆叶片表皮钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因克隆和表达分析

摘要

该研究采用RT-PCR技术并结合RACE策略,成功地首次从蚕豆下表皮和叶片中克隆了编码CDPK的全长cDNA VfCPK1和cDNA片段VfCPK2,并对VfCPK1的表达特征进行了初步研究.研究结果表明,用RT-PCR技术,以CDPKs激酶区的保守氨基酸设计的一对简并引物,从蚕豆下表皮中扩增到了3个141bp(141-1、141-2和141-3)的cDNA片段;用RACE技术,以141-1序列设计的一对基因特异性引物,克隆到全长cDNA序列VfCPK1.用RT-PCR技术,以CDPKs激酶区和连接区的保守氨基酸设计的一对简并引物,从蚕豆叶片中还扩增到了3个618bp(618-1、618-2和618-3)的cDNA片段;用RACE技术,以618-1序列设计的一对基因特异性引物,克隆到了还缺少5'末端的cDNA片段VfCPK2.VfCPK1的全长为1785bp,其中编码区为1482bp,可编码493个AA,5'非编码区为127bp,3'非编码区为176bp,中间含有加尾信号AATAAA,末尾是poly(A).由编码区推测的VfCPK1的493个氨基酸序列具有已报道的CDPK的所有典型结构特征,由N端到C端可分为可变区、激酶区、连接区和调节区四个结构域.N端的可变区有26个氨基酸残基,没有豆蔻化所必需的保守序列MGXXC(S/Q)XXT,因此推测VfCPK1可能是水溶性蛋白.VfCPK1具有明显的Ca<'2+>/钙调素依赖蛋白激酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的激酶区以及类似于钙调素的钙结合区.激酶区长264个氨基酸残基,具有所有11个保守的亚结构域和15个对于真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶所必需的保守的氨基酸残基.连接区有31个氨基酸残基.C端的调节区有172个氨基酸残基,有4个非常保守的EF手性钙结合结构域.推测的VfCPK1蛋白质序列与植物中的许多CDPKs具有很高的同源性,包括大豆种子CDPKDa(同源性82﹪;29892113)、大豆SK5(CDPKα;同源性82﹪;116054)、大豆种子CDPKb(同源性80﹪;29892204)、马铃薯RiCDPK2(同源性79﹪;15289760)、大豆CDPKβ(同源性79﹪;2501764)、水稻CDPK(同源性78﹪;34147319)、玉米ZmCPK11(同源性78﹪;31747505)等.与拟南芥34个CDPKs相比,VfCPK1与AtCPK12、AtCPK4和AtCPK11的同源性最高,分别为77﹪、75﹪和74﹪.通过Northern和Western blot分析，我们研究了蚕豆钙依赖蛋白激酶VfCPK1在蚕豆不同部位包括根、茎、叶、叶肉和下表皮中的mRNA和蛋白质水平上的表达情况以及不同外界胁迫处理对VfCPK1表达的影响.实验结果表明，无论是在mRNA还是蛋白质水平上，VfCPK1都是在叶片中的表达量显著高于根和茎中的表达量，尤其是在下表皮中的表达量最大，而在根和茎中的表达量低.因此，VfCPK1主要分布于蚕豆的叶片中，尤其在下表皮中.当用不同浓度的PEG和不同的处理时间处理蚕豆叶片时，在mRNA和蛋白质水平上，VfCPK1在叶片中的表达量都有增加.当PEG处理浓度为20﹪时，VfCPK1的表达量最大.无论是在转录还是蛋白质水平上，20﹪PEG处理2h后，VfCPK1在叶片中的表达量开始升高，处理5h后，表达量达到最大.当用100μM ABA对蚕豆叶片胁迫处理不同时间后，VfCPK1在叶片中的转录水平的变化呈现出类似于20﹪ PEG不同时间处理的表达模式.

目录

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摘要

Abstract

缩略词

第一部分文献综述

第一章生物体内的蛋白激酶

1.1前言

1.2蛋白激酶的结构、生化特性及其和信号转导的关系

1.3蛋白质的可逆磷酸化

1.4植物蛋白激酶与逆境信号转导

第二章CDPKs结构、生化性质、基因克隆及在钙信号转导中的作用

2.1引言

2.2 CDPKs的结构

2.3 CDPKs的生化性质

2.4 CDPKs的基因克隆

2.5 CDPKs在植物Ca2+信号转导中的作用

2.6总结和展望

2.7本研究的目的及意义

第二部分研究报告

第三章蚕豆钙依赖蛋白激酶基因VfCPK的克隆及序列分析

3.1前言

3.2材料和方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章蚕豆钙依赖蛋白激酶基因VfCPK1的表达分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章结论

5.1主要结论

5.2主要创新点

5.3建议

参考文献

附录

致谢

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