葡萄果实中脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶：纯化、测序及定位

摘要

本实验应用胶内蛋白激酶自磷酸化分析表明，在葡萄果实微粒体中存在一种分子量约为62.5KD的钙依赖的蛋白激酶(CDPK)，并且，外源ABA处理能激活这一蛋白激酶。由于CDPK和信号转导有关，是一种重要的信号分子，因此我们将实验的重点放在了这个蛋白激酶的纯化上。　　制备葡萄果实微粒体，经过大量的SDS-PAGE电泳，将目的蛋白从胶上洗下来，低压冷冻干燥、富集，得到了电泳纯的目的蛋白。应用双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis)鉴定纯化产物的纯度，结果表明纯化产物中存在着分子量相近，但等电点不同的两种蛋白；接着分别用葡萄果实中CDPK(VCPK1)的全长和N-端特异抗体与双向电泳分离后的蛋白发生免疫反应，对纯化产物进行进一步的鉴定，准确地将目的蛋白从纯化产物中鉴定并分离出来。应用串连质谱仪(LC-MS/MS)测定目的蛋白CDPK的蛋白酶解的氨基酸序列，得到了MAPDKPLDSAVLSR；VIAEGLSEEEIGGLR；LTAHEVLSHPWVVDDR；NNLNLGDVLGIPDMR等序列。依据序列在数据库中检索发现，纯化的蛋白激酶的序列和本实验室利用CDPK的保守序列设计简并引物，筛选葡萄cDNA文库得到的一个CDPK基因编码的蛋白(VCPK1)序列完全相同，因此断定二者是同一种蛋白。筛选得到的CDPK已在genebank登录，注册的基因和蛋白的序列号分别是gi39598579/gbAAR28766.1。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

独创性声明和关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

1脱落酸在果实生长发育中的作用

1.1果实成熟的两种类型

1.2脱落酸对果实成熟的调控

2脱落酸信号转导机理

2.1 ABA的感知

2.2第二信使

2.3 ABA信号调节蛋白

2.4下游信号组分

3依赖钙不依赖钙调素的蛋白激酶(CDPK)

3.1 CDPK的结构

3.2 CDPK的理化特征

3.3 CDPK的活性调调节

3.4 CDPK在植物信号转导中的作用

3.5 CDPK的专一性

4绿色荧光蛋白(GFP)

5总结与展望

6本研究的意义

第二章脱落酸激活葡萄果实中一种钙依赖的蛋白激酶(CDPK)

1材料与方法

1.1植物材料

1.2化学试剂

1.3果实组织园片温育方法

1.4果肉微粒体的制备

1.5蛋白质含量的测定

1.6 SDS-PAGE和Western-blot

1.7微粒体蛋白胶内自磷酸化

2结果与分析

2.1葡萄果实中存在钙依赖的蛋白激酶(CDPK)

2.2脱落酸(ABA)激活葡萄果实中钙依赖的蛋白激酶(CDPK)

3讨论

第三章葡萄果实中钙依赖蛋白激酶的纯化与测序

1材料与方法

1.1植物材料

1.2化学试剂及仪器

1.3果肉微粒体的制备

1.4蛋白质含量的测定

1.5钙依赖蛋白激酶的纯化

1.6纯化产物的胶内自磷酸化检测

1.7纯化蛋白的双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis)检测

1.8纯化产物的Western-blot检测

1.9串联质谱测定蛋白的序列

2结果与分析

2.1纯化产物的SDS-PAGE检测

2.2葡萄果实中纯化的钙依赖蛋白激酶(CDPK)的特性

2.3纯化产物的双向电泳和Western-blot的检测

2.4串联质谱测定纯化CDPK的序列

3讨论

第四章葡萄果实钙依赖蛋白激酶的定位

1 GFP-VCPK1融合基因的构建及其在拟南芥、洋葱中的瞬时表达

1.1实验材料

1.2化学试剂

1.3实验方法

1.4实验结果

1.5结论与讨论

2葡萄果实中VCPK1的胶体金免疫电镜定位

2.1实验材料和化学试剂

2.2样品包埋

2.3免疫染色

2.4结果与讨论

3葡萄果实中VCPK1的生化定位

3.1实验材料

3.2化学试剂

3.3实验方法

3.4结果与分析

讨论与结论

参考文献

致谢

个人简历