番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析

摘要

本文对番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能进行了分析研究。文章通过离体番茄果实的真空渗透，活体果实的果实表面，果柄和果茎注射等方式侵染番茄果实，烟草脆裂病毒在番茄果实中能有效的复制和转移。尽管上述四种方法均能对番茄果实形成有效侵染，但花后10天的番茄果实果柄注射是在番茄果实中建立病毒诱导基因沉默的最有效方法。LeEIN2基因沉默抑制了番茄果实的成熟，而沉默果实的红色组织具有较高的E4基因表达水平。这些结果显示LeEIN2基因在番茄果实成熟过程中扮演着重要角色。本文第一次在番茄花和果实中建立了病毒诱导的基因沉默体系，该方法将有利于对番茄果实发育和成熟相关基因进行大规模功能分析。在番茄果实中建立的病毒诱导基因沉默体系也将便于直接在番茄果实中进行成熟相关基因的大规模和高通量分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述与立题分析

1.1病毒诱导基因沉默的研究进展

1.1.1 RNA沉默的发现

1.1.2 RNA沉默机制

1.1.3 VIGS优缺点

1.1.4 VIGS载体

1.1.5病毒侵染方式

1.1.6 VIGS的应用

1.1.7 VIGS的抑制

1.2乙烯生物合成和信号传导的研究进展

1.2.1乙烯生物合成

1.2.2乙烯信号传导

1.2.3番茄果实成熟的乙烯调控

1.3本研究目的与研究内容

1.3.1目的意义

1.3.2研究内容

第二章番茄幼苗VIGS体系的建立

2.1引言

2.2材料与试剂

2.2.1植物材料

2.2.2菌株与质粒

2.2.3酶及试剂

2.2.4常用试剂配制

2.2.5主要仪器设备

2.3实验方法

2.3.1番茄叶，花和果实总RNA的提取

2.3.2番茄PDS基因的扩增

2.3.3DNA快速回收

2.3.4质粒转化和提取

2.3.5农杆菌侵染

2.3.6番茄植株PDS基因沉默分析

2.4结果与分析

2.4.1番茄果实RNA提取

2.4.2 PDS基因克隆及序列分析

2.4.3病毒载体TRV-PDS构建

2.4.4侵染方法的建立

2.4.5番茄幼苗VIGS体系优化

2.4.6叶片基因沉默分析

2.4.7花基因沉默分析

2.4.8果实基因沉默分析

2.4.9八氢番茄红素分析

2.4.10PDS基因半定量RT-PCR

2.4.11病毒的分子检测

2.5讨论

2.5.1 VIGS与反义转基因技术之比较

2.5.2 TRV诱导番茄植株的基因沉默

第三章番茄果实VIGS体系的建立

3.1前言

3.2材料与试剂

3.2.1植物材料

3.2.2 Southern杂交用试剂

3.2.3主要仪器设备

3.3方法

3.3.1离体番茄果实的真空渗透

3.3.2番茄果实乙烯含量的测定

3.3.3番茄果实ACC含量分析

3.3.4 PCR Southern杂交

3.4结果与分析

3.3.1 TRV侵染番茄果实

3.4.2离体番茄果实VIGS体系的建立

3.4.3活体番茄果实VIGS体系的建立

3.5讨论

3.5.1病毒侵染方式的选择

3.5.2果柄注射方法的优越性

3.5.3沉默信号传导的迷惑

第四章LeEIN2基因在番茄果实成熟调控中的作用

4.1前言

4.2材料与试剂

4.3方法

4.3.1 LeEIN2基因片段克隆

4.3.2番茄基因组DNA的Southern杂交

4.4结果与讨论

4.4.1病毒载体TRV-LeEIN2构建

4.4.2LeEIN2基因拷贝数分析

4.4.3果柄注射诱导番茄果实LeEIN2基因沉默

4.4.4叶片侵染诱导番茄果实LeEIN2基因沉默

4.5讨论

第五章全文总体结论与展望

5.1全文总体结论

5.2本研究的创新点

5.3研究展望

参考文献

致谢

作者简历